吲哚克酮酸的合成及其作为光声成像造影剂的初步研究

鲁 亮, 郭 丽, 胡曰富, 齐庆蓉

(四川大学 华西药学院，四川 成都 610041)

·研究论文·

吲哚克酮酸的合成及其作为光声成像造影剂的初步研究

鲁 亮, 郭 丽, 胡曰富, 齐庆蓉*

(四川大学 华西药学院，四川 成都 610041)

以克酮酸和2,3,3-三甲基-3H吲哚为原料，经缩合反应合成了吲哚克酮酸(ICR)，其结构经1H NMR和MS确证。并将ICR作为光声成像造影剂进行了初步研究。结果表明：ICR在近红外区的吸收强烈且尖锐，最大吸收波长为755 nm，发射波长为775 nm，摩尔吸光系数为4.14×105L·mol-1·cm-1； ICR的体外光声成像造影效果远大于吲哚菁绿(ICG)，在浓度为21.6 μmol·L-1时，ICR的光声强度是ICG的52万倍。

克酮酸; 2,3,3-三甲基-3H吲哚; 吲哚克酮酸; 合成; 光声成像; 近红外区; 吲哚菁绿

光声成像(Photoacoustic imaging， PAI)技术是21世纪兴起并发展迅速的一种新型非入侵式生物医学成像模式[1]，结合了光学成像和声学成像的优点，可得到深层组织高分辨率和高对比度的图像，是目前临床诊断的研究热点之一。但人体许多组织都是强散射或强吸收介质，而光在强散射组织中的成像深度只能达到1 mm左右[2]，为了实现深部诊断，采用光声造影剂对光声成像信号进行增强是其中一个主要的发展趋势[3-5]。但目前研究报道的造影剂较少，主要为基于金纳米棒[6]的纳米材料和有机功能染料吲哚菁绿(indocyanine green， ICG， Chart 1)。 ICG是目前唯一被FDA批准用于临床的染料分子，但其在水溶液中不稳定及光稳定性较差，且在体内清除快[7]。因此开展新型光声成像造影剂的研究意义重大。

Scheme 1

Chart 1

吲哚克酮酸(ICR)是克酮酸菁染料的一种，其最大吸收波长为755 nm，发射波长为775 nm，且吸收峰尖锐，摩尔吸光系数大[8]。相对于ICG的多甲川链，ICR引入了环状的克酮酸结构，提高了分子的刚性和空间位阻,不利于单线态氧的进攻，因此，ICR较ICG更稳定[9]。李忠玉[8,10]等进行了ICR三阶非线性光学性质的研究，结果表明：ICR具有大的三阶非线性极化率和快的非线性光学响应，在非线性光学材料方面有潜在的应用价值。Encinas等[11]提出了ICR可应用于光学传感器上的pH敏感组件。Punzi[12]等研究了克酮酸染料作为分子材料在晶体管中的应用。但到目前为止，还没有文献报道ICR在生物医学尤其是光声成像方面应用的研究。

本文参考文献[13]方法，以克酮酸和2,3,3-三甲基-3H吲哚为原料，经缩合反应合成了ICR(Scheme 1)，其结构经1H NMR和MS确证。利用小动物活体成像仪首次对其进行了体外光声成像测试，并与ICG作了对比。结果表明：ICR比ICG有更好的成像效果，为光声成像造影剂的研究提供了思路。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

自制毛细管熔点测定仪；SPD UV-3600型紫外分光光度计；Lumina型荧光光谱仪；Varian InovaA400型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Agilent1946B ESI-MS型质谱仪；iThera Medical型小动物活体成像仪。

胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；琼脂粉，天津市科密欧化学试剂有限公司；20%脂肪乳注射液，华润制药有限公司；2,3,3-三甲基-3H吲哚，湖北巨胜科技有限公司；克酮酸，东京化成工业株式会社；甲苯、正丁醇、甲醇、二氯甲烷和二甲基亚砜，分析纯；实验用水为去离子水。

1.2 ICR的合成

在三口瓶中依次加入克酮酸0.10 g(0.70 mmol)， 2,3,3-三甲基-3H吲哚0.22 g(1.40 mmol)，甲苯15 mL和正丁醇45 mL，搅拌使其溶解；利用分水器除去反应生成的水，回流(110 ℃)反应6 h[TLC检测，展开剂：环己烷/丙酮=3/1(V/V)]。减压蒸除部分溶剂，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=100 ∶1]纯化得墨绿色固体ICR 0.13 g，收率43.9%；1H NMR(400 MHz)δ： 7.58(d,J=7.2 Hz, 2H), 7.51(d,J=7.1 Hz, 2H), 7.37(t,J=14.4 Hz, 2H), 7.23(t,J=14.0 Hz, 2H), 6.0(s, H), 5.97(s, H), 1.5(s, 12H)； MSm/z： 424.7{[M+H]+}。表征数据与文献[13]报道一致。

1.3 光学性质测定

精密称量ICR配制10 mmol·L-1DMSO溶液备用。用甲醇稀释为1.25 μmol·L-1测定其紫外-近红外吸收光谱及荧光发射光谱。

1.4 体外光声成像测试

(1) 仿体模型的制备

取1.30 g琼脂粉、20%脂肪乳注射液5 mL和去离子水94 mL加至250 mL烧杯中，加热煮沸2 min；冷却至50 ℃，沿壁倒入20 mL注射器中，在中心垂直放置一根塑料管(4 cm×3 mm)，使其浸没长度为3 cm，冷却后将塑料管缓慢取出，溶液备用。

(2) 溶液的配制

分别称取ICR 11.4 mg和ICG 21.0 mg溶于适量甲醇中，分别用水、血清稀释至10 mL，再精确移取1 mL稀释至25 mL，制成浓度为0.108 mmol·L-1溶液备用。

(3) 体外光声成像测试

取1.4(2)溶液分别稀释为10.8, 21.6, 32.4, 43.2, 54.0, 64.8和75.6 μmol·L-1，分别以去离子水和血清为空白对照，各自取样逐一放入仿体模型的孔洞中，再置于小动物活体成像仪中，以680～960 nm(以每5 nm的幅度增加)脉冲激光照射，采集信号，获得光谱图与数据。

2 结果与讨论

2.1 光谱性质

ICR在甲醇中的的吸收光谱(A)与发射光谱(B)见图1。由图1可见，ICR在甲醇中最大吸收波长为755 nm，发射波长为775 nm，均与文献[13]报道一致。Stokes shifts为20 nm；摩尔吸光系数为4.14×105L·mol-1·cm-1。表明ICR的最大吸收和发射均在近红外区，且摩尔吸光系数较大。

2.2 体外成像效果

分别以水和血清为溶剂考察了ICG和ICR同一浓度溶液的光声成像效果，结果见图2。由图2可见，在同等条件下，ICR比ICG有更强的显影效果。在以血清为溶剂时，光声成像信号强度略小于在水中的信号强度，可能是因为在血清中的溶解度偏低，使荧光强度减弱。

λ/nm

λ/nm

进一步考察了ICR与ICG以水为对照时不同浓度的光声效果，结果见图3。由图3可以看出，随着浓度增加，ICR与ICG的信号强度不断增强，但ICR增加的幅度和成像效果优于ICG。

以水为溶剂测定ICR与ICG的光声成像结果，结果见表1。由表1可知，在相同浓度下ICR的光声强度远大于ICG，在浓度为21.6 μmol·L-1时，ICR的光声强度是ICG的52万倍。同时，根据表1中的浓度和光声强度作图，经计算可知，在21.6～75.6 μmol·L-1浓度范围内，ICR的相关系数R为0.99， ICG的相关系数R为0.92，可见在此浓度范围内ICR比ICG有更好的浓度相关性。

ICG(水为溶剂)

ICG(血清为溶剂)

ICR(水为溶剂)

ICR(血清为溶剂)

c/μmol·L-1PAamplitudeComp10．821．632．443．254．064．875．6ICR845．8563745．2371177．5883286．8390210．47103562．36107653．02ICG0．06800．12120．14430．16070．19070．23530．3553比值12439525951493261518275473049440129302992

图3 不同浓度的ICR与ICG光声成像效果图*

3 结论

合成了吲哚克酮酸(ICR)，对其进行了结构确证和光学特性表征，并在相同条件下与ICG的体外光声成像效果进行了对比。结果表明：在同一浓度下ICR的光声成像强度远远大于ICG，有望成为新型光声成像造影剂。

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Synthesis and Preliminary Study of Indole Croconium as Photoacoustic Imaging Contrast Agent

LU Liang, GUO Li, HU Yue-fu, QI Qing-rong*

(West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Indole croconium(ICR) was synthesized by condensation reaction of croconic acid with 2,3,3- trimethylindolenine. The structure was confirmed by1H NMR and MS. The preliminary study of ICR as a photoacoustic imaging contrast agent was investigated. The results showed that ICR exhibited a sharp and strong absorption in the near infrared region, the maximum absorption wavelength was 755 nm and emission wavelength was 775 nm, and the molar absorption coefficient was 4.14×105L·mol-1·cm-1. The photoacoustic imaging effect of ICR was far better than that of the indocyanine green(ICG). Photoacoustic intensity of ICR was 520 000 times of that of ICG at the concentration of 21.6 μmol·L-1.

croconic acid; 2,3,3-trimethylindolenine; indole croconium; synthesis; photoacoustic imaging; near infrared region; indocyanine green

2016-12-13；

2017-02-22

重大新药创制：石药集团心脑血管药物创新综合平台建设(2013ZX09402103-1)

鲁亮(1991-)，男，汉族，湖北仙桃人，硕士研究生，主要从事药物合成的研究。 E-mail: 840299792@qq.com

齐庆蓉，副教授， Tel. 028-85502157, E-mail: qiqinrong@scu.edu.cn

R914; O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.04.16311