胰腺干细胞分化为胰岛细胞的诱导方法

段佳慧，赵冬冬，李凯新，赵晓艳，左文君，林树梅

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

专论与讲座

胰腺干细胞分化为胰岛细胞的诱导方法

段佳慧1，赵冬冬，李凯新，赵晓艳，左文君，林树梅*

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

糖尿病作为全球范围内的代谢性常见疾病，严重影响着患者的生命质量。常规的药物和胰岛素注射并不足以根治糖尿病。近年来，逐渐发展起来的干细胞的相关研究，有望从根本上治愈糖尿病及其并发症，因而成为治疗糖尿病的研究热点。而利用干细胞医治糖尿病的关键点是明确干细胞的来源及分化为胰岛细胞的诱导方法。论文针对胰腺干细胞存在部位及诱导方法的研究概况做一综述。

胰腺干细胞；糖尿病；诱导分化；胰岛素

近年来，随着人们生活质量的不断提高，糖尿病(DM)患者数量也在不断上升。有调查研究表明，2013年全世界约有8.4%的成年人糖尿病患者，高达3.82亿人。与人类的发病相似，宠物糖尿病(尤其是犬猫)也呈逐年递增趋势，而新近统计结果显示，宠物糖尿病发病率基本在0.5%～1.5%之间。糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，主要表现为血糖值高，并伴有神经系统、心血管、肾脏等功能障碍[1]。根据发病机制不同，糖尿病可分为1型(胰岛素依赖性糖尿病)和2型(非胰岛素依赖性糖尿病)糖尿病。1型糖尿病表现为胰岛β细胞胰岛素分泌障碍，患者需终生依赖胰岛素。2型糖尿病表现为胰岛素抵抗，主要由遗传因素和环境因素等引起[2]。针对于2 型糖尿病，临床上已经开发多种药物并得到应用，起到一定的控制血糖作用，但患者依然会出现一些急慢性并发症。显而易见，这不是最好的治疗糖尿病的手段。2000年加拿大学者埃德蒙创立了“埃德蒙法”，将分离出的胰岛细胞团移植入患者体内，是解决糖尿病问题的一大进步。但是，由于目前胰岛来源相对匮乏，并且需要患者长期使用免疫抑制剂，使其应用受到了一定限制。近年来，逐渐发展起来的干细胞的相关研究表明，胰腺干细胞可在体外诱导分化，将诱导分化形成的类胰岛细胞回植到患病动物体内，可以长期维持血糖的稳态[3]，有望从根本上治愈糖尿病及其并发症，为糖尿病的治疗提供了新的思路。

1 胰腺干细胞

人体内大部分细胞是已达到终末分化状态的细胞，如胰岛细胞。而胰腺干细胞是未达到终末分化状态的细胞，是能产生胰岛结构、能够进行自我复制、定向分化的未定型细胞，是成体干细胞的一种[4]。移植胰腺干细胞，既解决了胚胎干细胞的道德伦理争论，又不存在胰岛β细胞缺乏的弊端。

2 胰腺干细胞的鉴定与分化

目前认为胰腺干细胞主要存在于胰腺的腺泡、导管和胰岛中，而且有能力进一步分化为胰腺内分泌和外分泌细胞。但胰腺干细胞的鉴定目前尚无确定一致的方法，多数依赖胰腺中的细胞所表达的蛋白质作为分子标记物，如细胞角蛋白-19(cytokeratin-19，CK-19)、胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)、巢蛋白(nestin)。试验结果表明，在胰岛、胰腺导管及外分泌胰腺中均有nestin的表达[5]，研究发现，胰腺组织中表达nestin的细胞具备干细胞的特性，称nestin阳性胰岛前体细胞。此类细胞也表达PDX-1，它是胰岛细胞发育过程中早期的分化标志。而二者共表达被认为是胰腺干细胞的鉴定标志。研究发现，小鼠部分胰腺组织自体移植后，有CK-19和胰岛素表达，而对照组无相应抗原表达[6]。体外试验中胰腺导管上皮细胞和胰岛细胞在胃泌素与表皮生长因子共同作用下可促进分化成胰岛β细胞[7]。

3 胰腺干细胞诱导分化为胰岛细胞的方法

3.1 化学试剂体外诱导分化

目前胰岛细胞的获取办法，主要是基于Lumelsy等提出的五步诱导法[8]。通过分离纯化胰腺干细胞，然后进行体外培养，加入营养因子，并诱导分化为具有功能的胰岛结构。紧接着，改良后的Bose B的方法有效提高了诱导率，达到65%左右[9]。目前最主要的诱导分化方法是化学诱导法，它通过添加一些化学诱导剂，诱导产生胰岛素分泌细胞[10]。Yatoh S等[11]用胰腺肠癌抗原抗体处理导管细胞，得到了胰岛素分泌细胞。在导管细胞培养基中加入霍乱毒素或8溴环磷酸腺苷等促环磷酸腺苷生成剂，经过长期培养以后，发现了高表达的CK-19与Pdx1阳性细胞，当转染神经元素3蛋白(neurogenin3，Ngn3)之后，检测到了胰岛素。在外分泌细胞培养基中添加了Ngn3、Pdx1、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)，有胰岛β细胞产生[12]。另有研究表明，成年大鼠的胰导管上皮细胞在体外由肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF) 介导下也可以分化成β细胞[13]。张慧茹等[14]采用肝细胞生长因子加烟碱加葡萄糖组合，诱导分化仔猪胰腺干细胞，发现有胰岛素产生，并且比用胰高血糖素肽-1诱导产生的胰岛素水平要高。同时诱导产生的细胞具有一定的葡萄糖反应性，适当提高葡萄糖浓度，胰岛素释放量增加。

尼克酰胺是维生素B3的一种形式，可以通过代谢产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称辅酶1)广泛介入许多生命调节过程。尼克酰胺在体外定向诱导分化为胰腺前体细胞被广泛应用[15]。此外，还可作为β细胞分化的一种成熟的促进因子[16]。Kawakami M等[17]通过一种长春花生物碱-conophylline和尼克酰胺联合诱导新生仔猪胰腺细胞3周，发现有新生胰岛素分泌细胞产生，且具有较高的葡萄糖反应性。谢谦等[18]也发现，化学试剂尼克酰胺定向诱导胰腺干细胞，可产生胰岛样组织结构。

3.2 基因诱导方法

基因诱导方法通常是利用基因工程技术将与β细胞功能相关的基因或胰岛发育过程中关键的转录因子导入干细胞，促进其分化，得到目的细胞的手段[19]。Blyszczuk P等[20]利用基因诱导方法，通过反转录病毒，将目的基因PDX-1和Pax-4插入小鼠干细胞，发现插入Pax-4基因的干细胞在体外培养后获得了胰岛样细胞团，并产生胰岛素，细胞团移植回体内后出现血糖降低的情况。王鸿武等也发现转染Mafa基因的干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能[21]。同时体外超表达Ngn3和MafA诱导得到的细胞团也具有降低血糖的作用[22]。近几年，通过microRNA方法诱导筛选得到的miR-26、miR-182等也能够促进胰岛素分泌细胞形成。而miR-375则能靶向PDK1抑制胰腺干细胞分化[23]。

3.3 间充质干细胞促进胰腺干细胞向胰岛细胞分化

张迪等[24]在SD大鼠胰腺被膜下多点注射间充质干细胞，发现胰腺干细胞标志物nestin、PDX-1的mRNA表达量增高，并且胰岛素的mRNA表达量也增高，推测可能是干细胞向β细胞方向发生分化。因此张迪等认为，内源性胰腺干细胞在间充质干细胞的影响下，具有促进胰岛β细胞新生的功能，对试验性糖尿病大鼠有治疗作用。有研究发现，干细胞不仅具备较强的增殖和分化能力外，通过细胞共培养，使细胞间充分接触、融合，可促进细胞成熟和组织修复，进而维持正常组织细胞的功能。张育森等[25]发现，体外与胰岛共培养的胰腺干细胞存活时间加长，将干细胞移植入糖尿病大鼠左肾包膜下后，血糖降低。机制的存在可能是与干细胞间相互接触，能够分泌各种促进损伤修复、营养支持的可溶性因子有关 。

3.4 胰腺干细胞自体移植

因为细胞的分化受细胞外基质和胞内基因的协同作用，所以在体外模拟活体内干细胞巢的微环境，并促进干细胞定向分化具有较大难度。干细胞自体移植或许是可行的办法之一。研究人员尝试将胰腺干细胞直接移入体内，使其在体内微环境的作用下进行分化，得到胰岛素分泌细胞。章乐虹等[6]切除大鼠大部分胰腺(>90%)，并将筛选出的胰腺干细胞回植入大鼠自体皮下，植入自体胰腺干细胞8周起，受体鼠血糖水平、糖刺激的耐受能力与对照组有显著差异。受体小鼠在术后10周～12周移植物中发现胰腺样结构和胰岛素染色、CK-19染色阳性细胞。说明大鼠胰腺内存在胰腺干细胞，并在移植后能分化为胰岛素阳性细胞，有效改善鼠的血糖水平，同时避免了免疫排斥反应。张悦等[26]研究发现，胰腺实质内原位移植胰腺干细胞的胎鼠，血清胰岛素含量上升，高血糖症状有所缓解，病理切片可见外源性的细胞团，免疫组化显示nestin、胰岛素呈阳性表达。而肝及肾包膜下移植大鼠各项指标未见明显改善。提示这可能是活体内干细胞巢促使胰腺干细胞分化，促进胰岛样细胞团生成。

3.5 在体激活胰腺干细胞，促其分化为胰岛细胞

传统的糖尿病治疗药物主要通过刺激胰岛β细胞分泌胰岛素、提高机体胰岛素敏感性或延缓葡萄糖的生成来控制血糖水平，这对糖尿病有一定的缓解作用，却未能根治糖尿病或阻止糖尿病并发症的形成，甚至会增加胰岛细胞负担，加快胰岛细胞功能衰竭。目前，最好的治疗糖尿病的方法是开发一种新药，能在活体内促进胰腺干细胞分化为胰岛β细胞，既方便服用，又避免了胰岛细胞负担及胰岛移植的免疫排斥反应。目前科研工作者也正在不断尝试，我们期望在不远的将来成为现实。

综上所述，目前能分化为胰岛细胞的干细胞主要是胚胎干细胞和成体干细胞，胰腺干细胞作为成体干细胞，能够在一定条件下诱导分化为胰岛细胞。研究表明，目前通过细胞共培养和化学法诱导得到胰岛素分泌细胞的方法，较为常用，但转分化效率并不高。基因诱导法可直接获得目的产物，有望从根本上获取胰岛素分泌细胞，但安全性上有待探讨。胰腺干细胞自体移植较为安全，且无免疫排斥反应，临床上较为可行，有望成为糖尿病治疗的主要手段。同时，服用药物，在体激活胰腺干细胞，规避了上述多种诱导手段的缺点，且方便可行，将成为未来糖尿病治疗的趋势。

致谢：感谢沈阳农业大学畜牧兽医学院林树梅副教授对文稿所提的宝贵意见。

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2017-04-24

国家自然科学基金项目(31572481)

段佳慧(1993-)，女，辽宁昌图人，硕士研究生，主要从事基础兽医学研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0111-04