铁皮石斛多糖分子量测定及其影响因素分析

黄俊彬,黄丹丹,陈欢欢,李运容,魏 刚

(广州中医药大学中药学院,广东广州 510006)

铁皮石斛多糖分子量测定及其影响因素分析

黄俊彬,黄丹丹,陈欢欢,李运容,魏 刚*

(广州中医药大学中药学院,广东广州 510006)

目的:研究了铁皮石斛多糖的分子量及其主要的影响因素。方法:对铁皮石斛多糖进行了三次重复的提取分离,经过纤维素凝胶树脂DEAE-52和葡聚糖凝胶Sephacryl S-300柱进行纯化,得到一个多糖片段WDOPA并采用高效凝胶渗透色谱法进行多次的分子量测定。采用单因素比较的方法,分别用加热和超声的手段处理铁皮石斛多糖,考察不同的加热温度、时间及不同的超声功率、时间对铁皮石斛多糖分子量的影响。结果:该WDOPA的分子量为776054 u,RSD在10%以内,加热的温度及时间对多糖分子量的影响不明显,而超声功率、超声时间的不同对铁皮石斛多糖分子量影响较大,随着超声功率的加大及时间的延长,分子量逐渐变小。结论:该实验方法可用于测定多糖,且超声可用于改变铁皮石斛多糖的分子量,应用于筛选不同分子量的多糖片段。

超声降解,高效凝胶渗透色谱法,铁皮石斛,多糖,分子量

铁皮石斛作为石斛中的佳品,在现代研究中发现,其具有良好的抗氧化[1]、抗肿瘤[2]、降低血糖[3]以及提高机体免疫力[4]等作用。根据现在的植物化学成分及药理学分析,石斛的主要的活性成分为石斛多糖,且含量十分丰富[5],但由于提取、分离的方法不同,现有的文献中石斛多糖的分子量差异较大,从一百多万到几千的分子量都有[6],而不同的分子量片段的石斛多糖,活性的差异也较大[7]。可能影响到分子量大小的因素有提取、分离及纯化的方法,温度和时间等[8]。纤维素凝胶树脂和葡聚糖凝胶柱为常用的分离纯化方法[9]。

超声提取法作为一种简单高效的提取方式,在多糖的溶解过程中经常被采用,很多研究报道了超声提取法可以明显提高多糖的提取效率[10],但超声的方法是否会改变石斛多糖的结构及生物活性具有一定的不确定性,因此,探讨超声对石斛多糖的分子量是否有影响将对石斛多糖的研究具有重要的参考意义。

基于此,本研究对铁皮石斛多糖进行了三个批次的分离纯化及多次的分子量测定,并探讨超声的时间、功率以及加热的温度及时间对铁皮石斛多糖分子量的影响,以期可以得到一种可行的方法来获取不同分子量的石斛多糖片段,本实验首次进行了多次的重复性提取及测定来确定其分子量范围,且得到了一个分子量范围较为稳定的多糖片段WDOPA,对石斛产业的开发利用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铁皮石斛鲜条 批号20140412,购于淘宝店,经广州中医药大学魏刚研究员鉴定为铁皮石斛。

葡聚糖T系列(5000 u,批号00269;11000 u,批号00270;80000 u,批号00892;15000 u,批号00893;273000 u,批号00894;667000 u,批号00896) 美国sigma公司;DEAE纤维素DE-52 上海源叶生物科技有限公司;Sephacryl S-300 High Resolution GE公司。

纯净水 华润怡宝食品饮料(深圳)有限公司;石油醚 天津市百世化工有限公司;浓硫酸 广州市东红化工厂;苯酚 天津市永大化学试剂有限公司;无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、乙酸铵等 天津市大茂化工试剂厂 均为分析纯。

LC-20AT型高效液相色谱仪 日本岛津公司;蒸发光散射检测器ELSD 6000 广州万谱仪器有限公司;AB204-N型精密电子天平 梅特勒-托利多(Mettler Toledo)公司;KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司;电热套TC-15套式恒温器 新华市医疗器械厂;TD-5-A离心机 上海安亭科学仪器厂;SCIENTZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;中压层析柱(3.5 cm×55 cm)、中压层析柱(1.6 cm×80 cm)、HL-2D恒流泵、BS-100A自动部分收集器 上海沪西仪器分析有限公司;PL1149-1840凝胶色谱柱(Agilent,PL aquagel-OH MIXED-H 8 μm,300 mm×7.5 mm)、PL1149-6800保护柱(Agilent,PL aquagel-OH Guard 8 μm,50 mm×7.5 mm) 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 铁皮石斛粗多糖的提取制备 取鲜品铁皮石斛洗净泥沙,切碎,60 ℃烘干后打粉,过一号筛。精密称取10 g铁皮石斛粉末,置于1000 mL的圆底烧瓶中,加入石油醚100 mL,加热回流2 h,取出,放冷,滤过,弃去滤液,滤渣烘干后重新置于1000 mL的圆底烧瓶中,加入80%的乙醇加热回流2 h,取出放冷,滤过,弃去滤液。滤渣重新加入圆底烧瓶,加入纯净水300 mL,加热回流提取2 h,重复提取三遍,提取液4000 r/min离心10 min除去药渣,抽滤,合并滤液,减压浓缩至合适的体积,放冷,并边搅拌边缓慢的加入四倍体积的无水乙醇醇沉,得到白色絮状的多糖沉淀,并置于4 ℃冰箱过夜。4000 r/min离心10 min得到多糖,置于60 ℃烘箱烘干。将多糖重新溶解至合适的体积,置于分液漏斗中,根据样品和sevag试剂(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1)的体积比为4∶1的比例,缓慢加入sevag试剂,振荡5 min,静置后弃去下层溶液,并离心,5000 r/min,离心15 min,重复三次除去多糖溶液中的蛋白。最后,将上层溶液移出,重新加入四倍体积的无水乙醇醇沉,4000 r/min离心10 min得到多糖,置于60 ℃烘箱烘干,得到粗多糖,称重为2.2 g。按以上全部流程重复提取三份铁皮石斛样品,分别得到三个批次的铁皮石斛粗多糖YN1、YN2、YN3。密封干燥保存,备用。

1.2.2 铁皮石斛多糖进行纤维素凝胶树脂DEAE-52洗脱纯化 取300 mg的粗多糖加入10 mL的蒸馏水溶解,待溶解完全后经0.45 μm的微孔滤膜过滤以备上样。上样量为300 mg/10 mL,流速为1 mL/min,采用纯水洗脱,用自动收集器每10 min收集一管,并根据《中国药典》的苯酚硫酸法[11]在λmax=488 nm处测定其吸光度,并绘制洗脱曲线,根据洗脱曲线收集洗脱液,浓缩,冷冻干燥,得到多糖。三个批次的粗多糖分别上样。

1.2.3 铁皮石斛多糖进行葡聚糖凝胶Sephacryl S-300洗脱纯化 将上述1.2.2得到的多糖取100 mg重新溶解于5 mL水中,待溶解完全后经0.45 μm的微孔滤膜过滤以备上样。上样量为100 mg/5 mL,流速为0.5 mL/min,采用0.2 mol/L的NaCl溶液洗脱,用自动收集器每10 min收集一管,并根据《中国药典》的苯酚硫酸法测定在λmax=488 nm处其吸光度,并绘制洗脱曲线,根据洗脱曲线收集洗脱液,浓缩,透析,冷冻干燥,得到多糖片段WDOPA。三个批次的多糖分别上样。

1.2.4 加热温度及时间对铁皮石斛多糖分子量的影响 分别精密称取粗多糖样品5 mg共9份,再分别加入2 mL的蒸馏水,振荡使其充分溶解。9份样品依次编号为62,64,66;82,84,86;102,104,106三组,分别表示在60 ℃的水浴中加热2、4、6 h;80 ℃的水浴中加热2、4、6 h;100 ℃的水浴中加热2、4、6 h。样品加热完之后,冷却,用0.22 μm的水系微孔滤膜过滤,转移至液相瓶中,即得供试品溶液。

1.2.5 超声功率及时间对铁皮石斛多糖分子量的影响 分别精密称取粗多糖样品5 mg共12份,再分别加入2 mL的蒸馏水,振荡使其充分溶解。12份样品依次编号为11,12,13,14;21,22,23,24;31,32,33,34;三组,使用KQ-400KDE型高功率数控超声(功率4000 W),分别表示在40%的功率下超声降解0.5,1,2,4 h;70%的功率下超声降解0.5、1、2、4 h;100%的功率下超声降解0.5、1、2、4 h;降解完成之后,用0.22 μm的水系微孔滤膜过滤,转移至液相瓶中,即得供试品溶液。

1.3 数据统计分析

该实验采用了重复三遍的方法分别进行测定,采用单因素方法比较超声及加热对铁皮石斛多糖分子量的影响,结果以平均值及相对标准偏差的方式表示,计算结果根据标准曲线lgMw-RT推算其分子量。

2 结果与讨论

2.1 三个批次的铁皮石斛多糖DEAE-52洗脱曲线

三个批次YN1、YN2、YN3多糖的DEAE-52吸光度测定图1所示:可以看出,各个批次的DEAE-52洗脱曲线基本相似,只是吸光度的大小有所差异,代表洗脱下来的多糖含量的高低不同,而有吸收的范围是基本一致的,可以用于确定大致需要的洗脱时间。分别按其主要吸光度范围合并相应管数的多糖溶液,浓缩,干燥。

图1 三个批次的DEAE-52洗脱曲线Fig.1 The elution curves for three batches of DEAE-52

2.2 三个批次的铁皮石斛多糖Sephacryl S-300洗脱曲线

三个批次YN1、YN2、YN3多糖的Sephacryl S-300吸光度测定图2所示:三个批次的Sephacryl S-300洗脱曲线基本相似,而吸光度的大小存在差异,有吸收的管数存在细微的差别,故分别收集吸光度较大且共有的第一个峰的管数,即第21～45管的多糖溶液,合并,浓缩,透析,干燥。

图2 三个批次的Sephacryl S-300洗脱曲线Fig.2 The elution curves for three batches of Sephacryl S-300

2.3 高效凝胶渗透色谱法测定标准曲线

在多糖分子量的测定中,本实验采用了高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖的分子量,它具有快速、分辨率高,重现性好的特点[12-13]。分别称取已知分子量的葡聚糖标准品(5000,11000,80000,150000,273000,667000 u)各10 mg溶解于2 mL的纯净水中,待完全溶解后经微孔滤膜过滤,采用高效液相色谱仪和蒸发光散射检测器,进样量为5 μL,安捷伦凝胶色谱柱(Agilent,PL aquagel-OH MIXED-H 8 μm,300 mm×7.5 mm)与保护柱(Agilent,PL aquagel-OH Guard 8 μm,50 mm×7.5 mm)串联,流动相为20 mmol/L乙酸铵溶液,流速为0.5 mL/min,柱温箱40 ℃,漂移管110 ℃,气体流速2.0,增益1。根据标准品的保留时间及分子量,做出lgMw-RT标准曲线。实验结果如下,六个标准品的保留时间依次如下为19.97、19.40、17.50、17.00、16.66、16.12 min。根据标准品的保留时间及分子量,做出lgMw-RT标准曲线。如图3所示,y=-0.5258x+14.191,r=0.9959,表明线性关系良好。

图3 lgMw-RT标准曲线Fig.3 The standard curve lgMw-RT

2.4 精密度实验

取葡聚糖标准品(11000 u)供试品按2.3的液相条件,连续进样5次,根据其保留时间,计算其RSD。五次保留时间如下:19.40、19.390、19.37、19.42、19.39 min。根据lgMw-RT标准曲线,经计算,五次的平均分子量为9744 u,其RSD为2.3%,说明其精密度良好。

2.5 重复性实验

精密称取5份粗多糖样品各5 mg,再分别加入2 mL的纯净水,振荡使其充分溶解,用0.22 μm的水系微孔滤膜过滤,转移至液相瓶中,即得供试品溶液。将五份供试品按2.3的液相色谱条件分别进样,根据其保留时间,计算其RSD。五次样品的保留时间依次如下:15.08,15.03,15.03,15.03,15.07 min。根据lgMw-RT标准曲线,经计算,五次的平均分子量为1958855 u,其RSD为2.7%,说明其重复性良好。

2.6 稳定性实验

取编号31供试品放于4 ℃的冰箱中保存,分别于0,2,6,12,24 h后按2.3的液相条件进样,根据其保留时间,计算其RSD。五次进样的保留时间依次如下:16.28,16.34,16.33,16.32,16.31 min。根据lgMw-RT标准曲线,经计算,五次的平均分子量为416913 u,其RSD为2.8%,说明其样品的稳定性良好。

2.7 三个批次的铁皮石斛多糖片段的分子量测定

按照步骤2.3的液相色谱方法,依次将三个批次的铁皮石斛多糖WDOPA片段进行分子量测定,根据其样品保留时间及lgMw-RT标准曲线计算各自的分子量。并将这三个批次的样品送外检,结合两组数据,其计算结果如表1所示,从实验结果可见,由本课题组自己测定的三个批次的多糖的分子量分别为757623,851008,706703 u;平均分子量为771778 u,RSD为9.5%,外检的分子量数据为751703,838119,751169 u,平均分子量为780330 u,RSD为6.4%,两组数据的平均分子量为776054 u,RSD为7.3%。本实验不仅获得了一个相对稳定的铁皮石斛多糖片段WDOPA,可以为多糖药理方面的研究提供一定的实验基础。

表1 三个批次的WDOPA多糖分子量(u)Table 1 The molecular weight of three batches of WDOPA polysaccharide(u)

2.8 加热温度及时间对铁皮石斛多糖分子量的影响

按照步骤2.3的液相色谱方法,依次将样品进样测定保留时间,再根据lgMw-RT标准曲线计算各自的分子量。实验结果及图谱如表2和图4所示;从实验结果中可以发现,加热的温度及时间对铁皮石斛多糖的分子量影响不是很大,随着长时间的加热及温度的提高,铁皮石斛多糖的分子量有微小的变小,但趋势不明显。

表2 加热温度及加热时间对分子量的影响Table 2 The effects of heating temperature and heating time dealing on the molecular weight

图3 lgMw-RT标准曲线Fig.3 The standard curve lgMw-RT

2.9 超声功率及时间对铁皮石斛多糖分子量的影响

图4 加热组HPGPC液相图谱Fig.4 The HPGPC chromatography of the heating group

图5 40%超声功率的HPGPC液相图谱Fig.5 The HPGPC chromatography under 40% ultrasonic power

按照步骤1.2.2的液相方法,依次将样品进样测定保留时间,再根据lgMw-RT标准曲线计算各自的分子量。实验结果及图谱如表3和图5～图7所示;从结果中我们可以发现:超声的功率及时间对铁皮石斛多糖的分子量影响明显,随着超声功率的加大及超声时间的加长,铁皮石斛多糖的分子量逐渐减小,即超声功率越大,分子量越少,超声时间越长,分子量越小。且当多糖分子量降低到一定程度后,下降得趋势逐渐变缓。

表3 超声功率及超声时间对分子量的影响Table 3 The effect of ultrasonic power and ultrasonic time dealing on molecular weight

图6 70%超声功率的HPGPC液相图谱Fig.6 The HPGPC chromatography under 70% ultrasonic power

图7 100%超声功率的HPGPC液相图谱Fig.7 The HPGPC chromatography under 100% ultrasonic power

3 结论

本实验主要采用高效凝胶渗透色谱法测定铁皮石斛的多糖分子量,液相条件为20 mmol/L的乙酸铵单溶剂测定,只需通过计算保留时间推算其分子量。实验操作主要为加热及超声等单因素考察,简单易行,重现性较好。由结果表明,本实验得到的WDOPA多糖片段具有较高的稳定性,其分子量为78万左右,在10%的误差范围之内。且加热和超声均能影响铁皮石斛多糖分子量,但超声的作用效果更为明显。因此,加热和超声降解的方法可运用于得到分子量较小的铁皮石斛多糖片段。

在现在的铁皮石斛产业应用中,铁皮石斛类产品的开发是一个热点。大分子的多糖不仅溶解度较低,且活性并不是很明显。通过降低铁皮石斛多糖的分子量,可以明显改善石斛多糖的溶解度,有利于解决石斛饮料及酒剂的这一工艺难题,并明显改善铁皮石斛多糖的药用价值,这对铁皮石斛保健品的开发具有很大的应用价值。本实验过程中获得了多个不同分子量的多糖片段,但其结构及药理活性是否存在差异,还有待进一步的研究。

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Determination of molecular weight ofDendrobiumofficinalepolysaccharides and its influencing factors

HUANG Jun-bin,HUANG Dan-dan,CHEN Huan-huan,LI Yun-rong,WEI Gang*

(School of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangdong 510006,China)

Objective:In this study,the molecular weight of the polysaccharide fromDendrobiumofficinalewas detected and its main influence factors were discussed. Method:The polysaccharide of theDendrobiumofficinalewas obtained through extraction and isolation process. And the purified polysaccharide fraction named WDOPA was obtained using DEAE cellulose and sephadex gel Sephacryl S-300 column. The HPGPC method was performed to determine its molecular weight. The processing method for the polysaccharide fromDendrobiumofficinalewas heating and ultrasonic dealing. The influence factors such as heating temperature,heating time,ultrasonic power and duration time were investigated by single factor. Results:The molecular weight of WDOPA was 776054 u,RSD was within 10%. The heating temperature and time did not have significant effects on the molecular weight of the polysaccharide while the ultrasonic dealing had. As the ultrasonic power and duration time increased,the molecular weight of the polysaccharide decreased. Conclusion:This experimental method could be used for the detection of the molecular weight of the polysaccharide. Ultrasonic dealing would change the molecular weight of the polysaccharide fromDendrobiumofficinlae,this could be applied in produce polysaccharide with different molecular weight.

ultrasonic;High Performance Gel Permeation Chromatography(HPGPC);Dendrobiumofficinale;polysaccharide;molecular weight

2016-10-08

黄俊彬(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：创新中药研究与指纹图谱分析，E-mail：492818673@qq.com。

*通讯作者:魏刚(1969-)，男，本科，研究员，研究方向：创新中药研究与指纹图谱分析，E-mail：weigang021@163.com。

广东省省级科技计划项目(2013B060400022)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)07-0081-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.007