66份青海审定小麦及86份人工合成小麦抗秆锈病小种Ug99的基因组成分析

刘 韬，尚 玥，张 波，刘宝龙，陈文杰，张连全，刘登才,，张怀刚

(1.中国科学院 西北高原生物研究所,西宁 810008; 2.四川农业大学 小麦研究所,成都 611130;3.中国科学院大学,北京 100049)

66份青海审定小麦及86份人工合成小麦抗秆锈病小种Ug99的基因组成分析

刘 韬1,3，尚 玥1，张 波1，刘宝龙1，陈文杰1，张连全2，刘登才1,2，张怀刚1

(1.中国科学院 西北高原生物研究所,西宁 810008; 2.四川农业大学 小麦研究所,成都 611130;3.中国科学院大学,北京 100049)

为了分析抗秆锈病小种Ug99的基因在青海审定小麦和新合成的人工小麦中的分布状况，采用6个抗Ug99基因( Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43)的分子标记对青海省审定的66个小麦品种及86份人工合成小麦材料进行检测。结果表明：在青海审定的66个小麦品种中，有4个品种含 Sr33，占检测品种数的6.06%；1个品种含 Sr39，占检测品种数的1.52%；5个品种含 Sr40，占检测品种数的7.58%；4个品种含 Sr42，占检测品种数的6.06%；3个品种含 Sr43，占检测品种数的4.55%；同时含有2个抗性基因的品种仅有2个，占检测品种数的3.03%。在86份合成小麦材料中，有38份材料含 Sr33，占检测材料的44.19%； 31份材料含 Sr39，占检测材料的36.05%；9份材料含 Sr40，占检测材料的10.47%；3份材料含 Sr42，占检测材料的3.49%；6份材料含 Sr43，占检测材料的6.98%；同时含有2种抗性基因的材料有17份，占检测材料的19.77%。在66个小麦品种和86份人工合成小麦材料均未检测出 Sr36。人工合成小麦提供Ug99抗病基因资源，对改良普通小麦Ug99抗病性具有潜在价值。

普通小麦；人工合成小麦；Ug99 抗性基因

小麦秆锈病(Pucciniagraminisf.sp.tritici)是全球范围的小麦病害，对小麦破坏性极大,曾在大多数种植小麦的国家和地区出现过毁灭性的灾难[1]。秆锈病可使小麦减产高达75%，一些地区甚至绝收。而中国恰好处于小麦秆锈病流行的特定区域内[2]。20世纪30至60年代曾在中国爆发过的几次秆锈病，造成几乎毁灭性的减产。抗秆锈病基因 Sr31在育种中的广泛应用使得秆锈病在过去的40多年没有大面积爆发[2]。

但是 Sr31基因对1999年在乌干达出现的新致病小种Ug99不具抗性，秆锈病再次对小麦的生产产生巨大的威胁。按北美秆锈菌小种命名法则Ug99被命名为TTKS[3]，按照现在新的鉴别寄主的体系该命名为TTKSK[4]。同时随着孢子的不断传播，变种也在不断产生，2006年和2007年人们又发现了对抗性基因 Sr24和 Sr36具有高毒力的新变异株[5,12]。Ug99被发现的随后几年，其夏孢子借助盛行西风的高空气流，于2001年传到东非的肯尼亚，2003年突破东非的防线传入北非的埃塞俄比亚、苏丹等国，2007年越过红海传到也门，目前已传播至伊朗的部分地区[6]。如今，Ug99及其小种的传播速度比条锈病菌传播更快。专家们预计，由于Ug99及其小种突破了红海这道屏障，其在未来几年或几十年中，传播到世界各地将更加容易，甚至速度将更加迅速。当今世界90%以上的小麦对Ug99不具抗性[7]，2006年对中国118个小麦主栽品种在肯尼亚进行Ug99抗性鉴定，结果表明高感病品种占98.3%[8]。中国作为全世界的人口及粮食大国，所面临的潜在威胁将远超其他地区国家。而青海地处中国的西部，如果Ug99突破中国的边界，将是首当其冲的几个省份之一。

本研究利用与Ug99抗病基因紧密连锁的分子标记，对66份青海省审定的小麦品种和86份人工合成小麦材料进行抗性基因的组成鉴定，了解普通小麦品种及人工合成小麦的抗性基因分布现状，希望从人工合成小麦中发现Ug99抗性资源，为Ug99抗性基因分子聚合育种提供理论依据及材料信息。

1 材料与方法

1.1 供试材料

青海审定小麦品种66份(表1)及人工合成小麦86份(表2)，Ug99抗性基因的材料：RL5405(Sr33)、Lang(Sr36)、RL5711(Sr39)、RL6087(Sr40)、Ac-Cadillac(Sr42)、Sr43(Sr43)共6份材料。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采集66份青海审定小麦、86份人工合成麦以及抗病亲本适量的新鲜叶片，在液氮中冷冻研磨后，用CTAB法[10]提取基因组DNA，用微量紫外检测仪NANODROP2000C(Thermo)测量DNA质量浓度。将DNA均稀释到200 mg/L，用10 g/L的琼脂糖胶在110 V电压下电泳30 min，检测DNA的质量。

1.2.2 特异性引物的选择 Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43是目前发现能有效抵抗Ug99及其绝大部分毒力变种的秆锈菌抗性基因[9，11-14]。上述基因已分别在小麦染色体上定位： Sr33定位到1DL[11]， Sr36定位到2BS[15]， Sr39定位到2B[12]， Sr40定位到2BS[15]， Sr42定位到6DS[13]， Sr43定位到7D[15]。根据查阅相关NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、参考文献以及GrainGenes 2.0(http://wheat.pw.usda.gov)得到相应的引物序列，通过试验对比选取稳定性较高的6对引物(表3)，引物均由奥科鼎盛生物公司合成。

表1 66份青海省审定小麦品种Table 1 66 wheat cultivars released in Qinghai province

表2 86份人工合成小麦Table 2 86 synthetic hexaploid wheat lines

表3 微卫星引物Table 3 SSR markers

1.2.3 PCR扩增及电泳检测 用6对引物对66份青海审定小麦品种以及86份人工合成麦的基因组进行PCR扩增分析。PCR扩增体系(20 μL)为：10×Taqbuffer(200 mmol/L Tris-HCl;200 mmol/L KCl;15 mmol/L MgCl2)2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，2.5U/μLTaqDNA polymerase 0.4 μL，各引物(除FSD-RSA为FSD 12 pmol，RSA 3.5 pmol)正反序列均为5 pmol，DNA 200 ng。PCR程序为：95 ℃变性 4 min，然后35个循环的95 ℃变性 30 s，47～62 ℃复性(各引物根据试验前期摸索的最适退火温度确定)30 s，72 ℃ 延伸20 s，最后72 ℃延伸 10 min。不同的PCR产物根据 Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43的目的条带大小，制作各自的琼脂糖分离胶浓度；然后在TAE缓冲液中，110 V电压下，电泳30 min；取出后在凝胶成像仪中拍照保存。

1.3 遗传组成分析

对66份青海审定的小麦品种和86份人工合成小麦的6个抗病基因进行统计分析，并对比抗病基因在2个群体中的存在频率。

2 结果与分析

2.1 SSR引物的筛选及最适退火温度的确定

由于参考文献和数据库中给出的引物有多对，最终筛选到最适合的6对引物和其最适退火温度(表3)： Sr33的引物Xcfd15，62 ℃； Sr36的引物STM773-2，61 ℃； Sr39的引物Sr39#2r，56 ℃； Sr40的引物WMC-661，56 ℃； Sr42的引物FSD-RSA，47 ℃； Sr43的引物Cfa2040，58 ℃。

2.2 各抗性基因在普通小麦及人工合成小麦中的分布

用确定的6对引物和最适退火温度对66份青海审定的小麦品种和86份人工合成小麦共152份材料分别进行PCR扩增检测，部分电泳结果见图1。结果发现(表4)，在青海审定的66小麦品种中，有4个品种含抗性基因 Sr33，所占比例为6.06%；1个品种含 Sr39，所占比例为1.52%；5份品种含 Sr40，占检测品种数的7.58%；4份材料含 Sr42，所占比例为6.06%；3份含 Sr43，占检测品种数的4.55%。

M.1 kb plus DNA ladder；1.阳性对照 RL5711 Positive control RL5711；2.阴性对照Ps4-1 Negetive control Ps4-1；3.空白对照 Blank；4～24.部分检测样品 Some detected samples

图1 引物Sr39#2r对部分合成麦的检测
Fig.1 Molecular identification of some synthetic hexaploid wheats with marker Sr39#2r

86份人工合成小麦的检测结果(表5)发现，有38份含抗性基因 Sr33，比例高达44.19%；31份材料含 Sr39，占36.05%；9份含 Sr40，占检测材料的10.47%；3份材料含 Sr42，占3.49%；6份材料含 Sr43，占检测材料的6.98%。

在66个小麦品种和86份合成麦材料均未检测出 Sr36抗性基因。结果还发现，在检测的小麦品种中同时含有2个抗性基因的品种仅有2个(表4)，占检测品种数的3.03%；而在检测的合成麦中同时含有2种抗性基因的材料有17份(表5)，占检测材料的19.77%；在普通小麦品种和人工合成麦中均未检测到同时含有3个及以上抗性基因的材料(表4、5)。

以上结果说明合成麦中的抗性基因分布明显要高于现有的小麦品种中的抗性基因分布(图2)，也表明同时聚合多个抗性基因的品种很少，每个品种的抗性基因过于单一。

表4 66份青海审定小麦品种抗Ug99基因检测结果统计(阳性 +，阴性 -)Table 4 Molecular detection results of stem rust resistance genes in 66 wheat cultivars released in Qinghai province (presence +,absence -)

表5 86份人工合成小麦抗秆锈基因检测结果统计(阳性 +，阴性 -)Table 5 The detection results of stem rust resistance genes in 86 synthetic hexaploid wheat lines (presence +,absence -)

(续表5 Continued table 5)

样品名称Samplename杂交组合Crosscombinations抗秆锈基因StemrustresistancegeneSr33Sr36Sr39Sr40Sr42Sr43Syn⁃SAU⁃46PI191781×AS2399+-----Syn⁃SAU⁃48PI221403×AS2399------Syn⁃SAU⁃49PI221403×AS2404+-----Syn⁃SAU⁃50PI306533×AS2405--+---Syn⁃SAU⁃51PI350001×AS2405+-----Syn⁃SAU⁃54PI352335×AS2386+-----Syn⁃SAU⁃55PI352358×AS65------Syn⁃SAU⁃57PI352367×AS2386--+--+Syn⁃SAU⁃59PI352369×AS60--+--+Syn⁃SAU⁃60PI355465×AS2405+-----Syn⁃SAU⁃61PI355476×AS2404+-----Syn⁃SAU⁃66PI355527×AS2399+-----Syn⁃SAU⁃67PI377655×AS2399+-----Syn⁃SAU⁃68PI377655×AS2386+-----Syn⁃SAU⁃69PI415152×AS60--++--Syn⁃SAU⁃70PI434998×AS2386------Syn⁃SAU⁃73PI184543×AS2386+-----Syn⁃SAU⁃74PI211691×AS2386------Syn⁃SAU⁃77PI532136×AS65-----+Syn⁃SAU⁃78AS2240×AS84--+---Syn⁃SAU⁃79AS2295×AS76---+--Syn⁃SAU⁃80AS2296×AS2388+-----Syn⁃SAU⁃81AS2298×AS79--+---Syn⁃SAU⁃82AS2299×AS79--+-+-Syn⁃SAU⁃83AS2308×AS72--+---Syn⁃SAU⁃84AS2308×AS81------Syn⁃SAU⁃85AS2310×AS60--+---Syn⁃SAU⁃86AS2313×AS2388+----+Syn⁃SAU⁃87AS2326×AS2388--+---Syn⁃SAU⁃88AS2334×AS2388--+---Syn⁃SAU⁃89AS2351×AS67--+--+Syn⁃SAU⁃90AS2378×AS82------Syn⁃SAU⁃91AS2380×AS77--+---Syn⁃SAU⁃92AS2381×AS65------Syn⁃SAU⁃93AS2382×AS2388+-----Syn⁃SAU⁃95PI154582×AS95--+---Syn⁃SAU⁃96PI221403×AS2397+----+Syn⁃SAU⁃98PI355507×AS2386+--+--Syn⁃SAU⁃99PI377655×AS2407+--+--Syn⁃SAU⁃103AS2380×AS95------Syn⁃SAU⁃106AS2291×AS2388+-----Syn⁃SAU⁃107PI113961×AS2403+-----

图2 各抗性基因在小麦品种和合成麦中的分布Fig.2 The distribution of each resistance gene in common wheats and SHW lines

3 讨 论

自从1B/1R易位系中的抗秆锈基因 Sr31在全球范围大量引入后，秆锈菌引起的大面积减产或绝收现象得到了有力的控制[5,8]。在过去的40多年里，小麦秆锈病也未在中国出现大流行。因此，除东北及内蒙古北部的春麦区外，其他麦区育种部门均不再重视秆锈病，致使主栽品种的抗秆锈病基因单一，仍以1BL/1RS 为主，总体抗病水平下降[16]。Ug99爆发后，以其迅猛的速度传播，越过红海后势头更甚，严重威胁着世界各地的小麦生产，其传播路线与国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)的地理信息系统(GIS)所预测的路线基本吻合[17]。据CIMMYT的GIS数据显示：2008年1月至7月曾有连续72 h的伊朗哈马达麦区上空的气流传入中国藏北、青海及甘肃的天气现象[18]。本试验研究青海审定的66份小麦品种，发现仅4份含抗性基因 Sr33，1份含抗性基因 Sr39，5份含抗性基因 Sr40，4份含抗性基因 Sr42，3份含抗性基因 Sr43。据调查和研究结果表明：作为青海省春小麦主栽品种的‘高原448’和‘阿勃’，均不带有以上6个抗秆锈基因中的任何一个(表4)。或许这将是一个极大的危险信号，一旦秆锈孢子借助夏季盛行的西风传入青海，极有可能会出现区域性的秆锈病区，以至中国内地省份逐渐爆发秆锈病，造成粮食减产甚至部分地区绝收，引发恐慌。本结论也可能存在不准确性，因为目前抗秆锈的基因还未完全发现，这些小麦品种中可能还含有本试验未检测的其他抗秆锈的微效基因。

本研究还表明，各个品种中含有的抗性基因极其单一。66份青海审定的小麦品种中仅2份含2个抗性基因。Ug99的爆发表现出秆锈病菌对 Sr31的抗性，单基因的存在也许能防一时之危，一旦病菌出现抗性变异，危害将令人措手不及。所以发掘、引进和合理利用优良的种质资源，在一个品种中聚合多个抗性基因，使得小麦抗性多样化，才是长久防治秆锈危害的重要手段。本试验同时也对86份人工合成小麦进行相应的抗性基因分布检测。结果显示，人工合成麦的抗性基因分布频率明显高于现有小麦品种。

人工合成小麦是利用小麦近缘物种远缘杂交创制而成。人工合成小麦的创制将近缘物种中的优良基因带入小麦的六倍体水平上，使得优良基因直接导入普通小麦中成为可能，极大地丰富小麦的基因库，从而为小麦引入更多可能的抗性基因。Ug99跨越红海进入伊朗后，对于中国西北地区小麦生产的潜在危害正与日俱增，因此，作为中国内陆小麦作物区域大门的青海，研究当地小麦品种的抗性基因分布，将人工合成麦的抗性基因导入普通小麦，通过基因聚合培育出含有多个抗性基因的优质抗病品种，防范于未然，是防止Ug99在中国爆发区域性流行和出现粮食安全问题的有效措施。

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(责任编辑：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Distribution of Stem Rust Race Ug99 Resistance Gene in 66 Bread Wheat Cultivars Released in Qinghai Province and 86 Synthetic Hexaploid Wheat Lines

LIU Tao1,3,SHANG Yue1,ZHANG Bo1,LIU Baolong1,CHEN Wenjie1,ZHANG Lianquan2,LIU Dengcai1,2and ZHANG Huaigang1

(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008,China;2.Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China;3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

To analyze the distribution of stem rust race Ug99 resistance genes in spring wheat cultivars which were released in Qinghai province and the new synthetic hexaploid wheat lines,six molecular markers of Ug99 resistant genes ( Sr33, Sr36, Sr39, Sr40, Sr42, Sr43) were applied to test sixty-six wheat cultivars which were released in Qinghai province and eighty-six synthetic hexaploid wheat lines. Of the sixty-six Qinghai released cultivars,four cultivars carry Sr33,one cultivars carry Sr39,five cultivars carry Sr40,four cultivars carry Sr42,and three cultivars carry Sr43,accounting for 6.06%,1.52%,7.58%,6.06%,and 4.55% of the detected samples,respectively. Only two cultivars contain two resistance genes,accounting for 3.03% of the number of detected cultivars. In eighty-six synthetic hexaploid wheats,thirty-eight lines contain Sr33,accounting for 44.19%. Thirty-one lines contain Sr39,accounting for 36.05%.Nine lines contain Sr40,accounting for 10.47%.Three lines contain Sr42,accounting for 3.49%. Six lines contain Sr43,accounting for 6.98%. Meanwhile,seventeen of eighty-six synthetic hexaploid wheat lines contain two resistance genes,accounting for 19.77%. Sr36 was not detected in both sixty-six bread wheat cultivars and eighty-six synthetic hexaploid wheat lines. The results indicated that synthetic hexaploid wheat could be a potential germplasm for wheat Ug99 resistance improvement.

Bread wheat； Synthetic hexaploid wheat；Ug99 resistance genes

LIU Tao,male,master student.Research area:wheat disease resistance genetics and breeding.E-mail:liutao415@mails.ucas.ac.cn

ZHANG Huaigang,male,researcher,doctoral supervisor.Research area:wheat genetics and breeding.E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn

日期：2017-03-30

2016-05-11

2016-06-28

中国科学院战略性A类先导科技专项子课题(XDA08030106)；青海省重点研发与转化计划项目(2016-HZ-808)。

刘 韬，男，硕士研究生，从事小麦抗病遗传育种研究。E-mail:liutao415@mails.ucas.ac.cn

张怀刚，男，研究员，博士生导师，主要从事小麦遗传育种研究。E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn 张 波，男，副研究员，硕士生导师，主要从事麦类作物遗传育种研究。E-mail:zhangbo@nwipb.cas.cn

S512.1；S326

A

1004-1389(2017)04-0523-10

ZHANG Bo,male,associate researcher,master supervisor.Research area:wheat genetics and breeding.E-mail:zhangbo@nwipb.cas.cn

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.012.html

Received 2016-05-11 Returned 2016-06-28

Foundation item The Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No.XDA08030106)；the Key Research Program of Qinghai Province(No.2016-HZ-808).