利用SSR标记对新疆部分向日葵自交系材料进行群体结构划分及聚类分析

刘胜利，段维，王鹏，柳延涛，王沛政

(1. 新疆农垦科学院作物研究所，新疆石河子 832000；2. 新疆康地种业科技股份有限公司，乌鲁木齐 830011；3.海南热带海洋学院，海南三亚 572022)

利用SSR标记对新疆部分向日葵自交系材料进行群体结构划分及聚类分析

刘胜利1，段维2，王鹏1，柳延涛1，王沛政3

(1. 新疆农垦科学院作物研究所，新疆石河子 832000；2. 新疆康地种业科技股份有限公司，乌鲁木齐 830011；3.海南热带海洋学院，海南三亚 572022)

【目的】序列位置标签(Sequence Tagged Site, STS)为一段短的DNA序列，在其生物染色体上只出现一次，适宜于作为作物基因组的一种地标。【方法】研究随机选取向日葵500对序列标签位点SSR引物，利用其中62对具有多态SSR标记对136份新疆食葵和油葵自交系进行PCR多态扩增和筛选。【结果】62对序列标签位点SSR标记在136份向日葵中扩增表现稳定多态，占所选引物数量的12.4%，扩增产物条带清晰、稳定和易读。136份向日葵群体基因型依据△K的变化，可以分为2大类群。其中73份油葵自交系材料中，70%自交系材料被分配到第1大群，油葵资源材料主要归类在第1大群。30份油葵保持系中只有4份保持系被分配到第2大群，其余保持系均在第1大群。而在43份油葵恢复系中有25份分配到第1大群，其余分配到其它群中，表明油葵恢复系遗传多样性较为丰富。在55份食葵自交系中，仅有21%食葵被分到第1大群，食葵资源材料主要属于第2大群。【结论】食葵的遗传多样性较油葵的遗传多样性丰富，食葵和油葵资源材料间有部分基因相互交叉渗透，为新疆向日葵核心种质的构建和资源的合理利用提供理论支持。

向日葵；序列标签位点；群体结构；聚类分析

0 引 言

【研究意义】向日葵(HelianthusannuusL.)因具有耐盐碱、耐瘠薄、抗旱、适应性强等特点，特别适合于我国西部地区种植[1]。向日葵主要有食用向日葵和油用向日葵两种。油用向日葵籽实含油率高，油品质量好，其中亚油酸含量达60%以上，现已成为世界第4大油料作物[2]。当前国外公司向日葵杂交种在中国占有很大市场，国内品种与国外品种综合性状相比还有一定差距，主要原因是目前我国向日葵种质资源材料的基础研究还比较薄弱[3]。近几年，分子标记技术已发展成为提高育种工作效率强有力的武器，对向日葵生物学研究具有重要意义。【前人研究进展】国外文献报道方面，Yue 等[4]等利用TRAP标记分析了177个向日葵自交系遗传多样性。Lawson等[5]用RAPD方法报道了7个自交系、5个澳大利亚地方栽培种等16个向日葵材料，材料之间的平均相似性达到了0.73。 Hongtrakul[6]等采用AFLP技术对24份油用向日葵自交系材料进行了分析。Norma等[7]用 SSR 分子标记报道了12个向日葵基因型，平均多态信息度(PIC)为0.57。Mokrani等[8]利用AFLP标记标记和SSR相结合的方法研究了向日葵的品质特性、含油率和一些重要的农艺性状。国内也有不少研究向日葵遗传多样性的报道[9-13]。向日葵群体遗传结构研究分析方面，Mandel等[14]利用来自美国和欧洲的433份向日葵栽培种质和24野生向日葵种为材料的群体遗传结构分析表明，所有向日葵种质可以分为4个结构群体，其中向日葵栽培种主要为两个群体。Marjan等[15]利用SSR标记对收集到的50份食用向日葵的群体结构分析表明，食用向日葵可以分为三大群。Filippi[16]等利用 137份向日葵自交系、13个开放授粉材料和20个复合品种的群体结构表明，利用SNP标记可以将群体划分2两群，而SSR标记可以将群体划分3群。国内外研究向日葵遗传多样性研究报道不少，但对向日葵群体遗传结构分析的研究报道不多，尚未见研究新疆向日葵群体结构的研究报道。【本研究切入点】向日葵群体的遗传多样性分群划分通常依据个人经验，不同研究报道其群体的遗传多样性划分也不尽相同，人为因素影响较大。为准确划分新疆向日葵资源材料的群体结构、明确新疆食葵保持系和恢复系之间、油葵保持系和恢复系之间以及新疆食葵资源材料和油葵资源材料间的遗传差异。【拟解决的关键问题】研究以新疆食葵、油葵自交系以及部分油葵杂交种为材料，利用SSR标记，对其进行群体结构划分、聚类分析，为新疆向日葵核心种质的构建以及合理利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料由新疆农垦科学院作物所提供，共136份。其中，油葵保持系30份，恢复系43份，油葵杂交种8份，食葵保持系20份，恢复系35份。表1

1.2 方 法

DNA提取：供试材料种植于海南三亚农垦科学院试验田。取新鲜叶片，当天取样后直接提取基因组DNA。 DNA提取采用百泰克新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，最后得到的DNA样品用TE(Tris-EDTA)缓冲液溶解，放在-20℃的冰箱内保存。

TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker ladder、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和TEMED等主要生化试剂购自海南相关生物销售商，为国产分析纯。

SSR引物：SSR引物见Tang等[17](2002)报道的向日葵序列标签位点(sequence tagged site)序列，随机选取500对SSR引物，由上海生物工程公司合成引物，利用16份(分别为1-4,31-34,74-77,111-114)向日葵自交系材料进行扩增,进行多态筛选。

PCR 扩增、PCR反应程序以及变性聚丙烯酞胺凝胶参照有关文献[18]。

1.3 数据统计

应用STRUCTRE软件，对供试群体进行基于数学模型的类群划分。使用NTSYS-pc210e软件进行聚类分析，其参数设定见已发表文献[19]。

2 结果与分析

2.1 SSR引物筛选

利用向日葵500对序列标签位点SSR引物对16份向日葵自交系进行了PCR扩增筛选多态，筛选到62对序列标签位点引物，可用于新疆向日葵自交系分子水平的遗传分析。这些标记扩增产物条带清晰、稳定和易读，占所选引物数量的12.4%。列出62对序列标签位点SSR多态标记信息，其中56对标记引物扩增片段的重复为双碱基重复，占绝大多数，其余6对为多碱基重复。标记引物的PIC数值绝大部分都在0.5以上，表明其多态信息量丰富。PCR期望扩增长度都介于112～477 bp，没有大片段，易于扩增，对扩增反应条件不是很苛刻。退火温度介于52～60℃。

表1,表2

表1 新疆向日葵自交系材料
Table 1 Sunflower Inbred Lines of Xinjiang

编号No名称Name特性traits编号No名称Name特性traits编号No名称Name特性traits12541⊕-1油葵，恢复系473019-2油葵，保持系933386⊕食葵，恢复系22542⊕-1油葵，恢复系483021-1油葵，恢复系943248-6食葵，保持系32544⊕-4油葵，恢复系493027-1油葵，保持系953268-1食葵，保持系42549⊕-1R油葵，恢复系503034-1油葵，保持系963276-1食葵，保持系52564⊕-3油葵，恢复系513045-1油葵，保持系973242-4食葵，保持系62567⊕-4油葵，恢复系523030-1油葵，保持系983268-4食葵，保持系72584⊕-8油葵，恢复系532892-1油葵，保持系993244-1食葵，恢复系82587⊕-1R油葵，恢复系542702-1油葵，恢复系1003215-2食葵，保持系92588⊕-4油葵，恢复系552918-1油葵，保持系1013218-1食葵，保持系102591⊕-6油葵，恢复系562892-2油葵，恢复系1023232-1食葵，恢复系112597⊕-3油葵，恢复系572938-1油葵，保持系1033235-2食葵，恢复系122602⊕-1油葵，恢复系582914-1油葵，恢复系1043229-1食葵，保持系132605⊕-1油葵，恢复系592928-2油葵，保持系1053119-1食葵，恢复系142611⊕-1油葵，恢复系602647-1油葵，恢复系1063160B食葵，恢复系152613⊕-2油葵，恢复系612891-2油葵，保持系1073201-1食葵，保持系162619⊕-1油葵，恢复系622867-1油葵，保持系1083132-1食葵，恢复系172624⊕-1油葵，恢复系632648-1油葵，恢复系1097B-1食葵，保持系182627⊕-1油葵，恢复系642659-1油葵，恢复系1103126-1食葵，恢复系192631⊕-1油葵，恢复系652672-1油葵，恢复系1113324食葵，保持系202635⊕-3油葵，恢复系662655-1油葵，恢复系1123207-5食葵，保持系212638⊕-1油葵，恢复系672751-1油葵，恢复系1133226-1食葵，保持系222639⊕-1油葵，恢复系682707-1油葵，恢复系1143300-3食葵，保持系232695⊕-2R油葵，恢复系692776-1油葵，恢复系1153243-3食葵，保持系242708⊕-2油葵，恢复系702861-1油葵，保持系1163180-1食葵，保持系252719⊕-2R油葵，恢复系712880-1油葵，保持系1173114-1食葵，保持系262735⊕-2R油葵，恢复系722897-2油葵，保持系118184015食葵，恢复系272744⊕-2R油葵，恢复系73D874油葵，保持系1193329⊕-4食葵，恢复系282745⊕-2R油葵，恢复系743079食葵，恢复系1203022×2627油葵杂交种292746⊕-6油葵，恢复系753161⊕混食葵，恢复系1213028×2605油葵杂交种302830⊕-1R油葵，恢复系763302食葵，恢复系1223028×2588油葵杂交种312959-3油葵，保持系773303-2食葵，恢复系1233038×3039油葵杂交种322963-2油葵，保持系783304食葵，恢复系1243041×3040油葵杂交种332973-1油葵，保持系793307食葵，恢复系1253263×3187油葵杂交种342975-2油葵，保持系803308食葵，恢复系1263253×3318油葵杂交种352979-3油葵，保持系813309-1食葵，恢复系1273253×3319油葵杂交种362981-4油葵，保持系823310食葵，恢复系1283121食葵，恢复系372983-3油葵，保持系833311食葵，恢复系1293163食葵，恢复系382986-1油葵，保持系843312-8食葵，恢复系1303301食葵，恢复系392989-2油葵，保持系853313食葵，恢复系1313305-2食葵，恢复系402991-1油葵，保持系863314食葵，恢复系1323306食葵，保持系412997-1油葵，保持系873315食葵，恢复系1333214-1食葵，保持系422961-1油葵，恢复系883316-7食葵，恢复系1343246-1食葵，恢复系433003-1油葵，保持系893317-2食葵，恢复系1353223-1食葵，恢复系443009-2油葵，保持系903318-5食葵，恢复系1363322-1食葵，保持系453013-2油葵，保持系913319食葵，恢复系463015-1油葵，保持系923320食葵，恢复系

表2 SSR多态标记的基本统计信息
Table 2 Basic statistical information of SSR polymorphism marker

名称Name重复序列RepeatMotifs扩增长度ExpectedLength多态信息量PIC退火温度Ta名称Name重复序列RepeatMotifs扩增长度ExpectedLength多态信息量PIC退火温度TaORS294(AT)8(GT)6G(GT)5375062557ORS571(AG)9262062557ORS309(A)19121050057ORS615(CT)13320062560ORS311(AC)11320030057ORS631(CT)25152050052ORS313(AT)12(GT)11104030057ORS635(CT)12109050052ORS317(AC)11(AT)8(AG)6204037557ORS637(CT)16126062554ORS329(GT)6236037557ORS641(AG)7343037554ORS337(AC)15184050057ORS659(AG)8221037557ORS339(GT)11327020057ORS671(AG)20182037557ORS343(AC)8242037557ORS673(AG)21215062557ORS351(AC)11225062557ORS679(AG)16240062557ORS377(GT)18265012057ORS687(CT)14168075057ORS385(AC)23224062557ORS749(CT)13112075057ORS387(CT)7(AT)8(CT)9323037552ORS765(CT)14387062557ORS401(GT)15165037557ORS770(CT)14246050054ORS403(GT)8322050054ORS777(CT)14293037557ORS405(AC)11268050054ORS781(CT)5374062560ORS413(AC)8418050060ORS785(AG)17161062557ORS439(AC)7391050060ORS798(CT)8141062562ORS451(GT)9176050052ORS799(CT)13143062557ORS453(GTGTT)12305075057ORS802(GA)13395037560ORS455(GT)12167050057ORS803(CT)20165037557ORS475(GT)5302050057ORS830(GT)13213062559ORS493(AC)7350037560ORS844(AC)17307062559ORS496(AC)9178037557ORS845(AC)10360037559ORS521(AC)6477050057ORS852(GT)10(GA)9197037559ORS527(CT)7354050057ORS878(AC)112030559ORS531(AG)9365037557ORS903(AC)14347037559ORS539(CT)12255062554ORS904(GT)10172050059ORS549(AG)8354037560ORS906(GT)11274050059ORS565(AG)13145075054ORS924(AC)16284037559ORS569(AG)24190050052ORS925(AC)16201062559

2.2 参试材料的群体结构划分

136份向日葵资源材料群体基因型经过structure软件运行后得到的△K值与k变化关系，研究表明，当k=2时，△K达到最大，为85左右，然后迅速降低，在K为3～9时其△K基本降低到0附近，近似一条直线。因此依据△K的变化，参试的向日葵自交系材料群体可以划分为2大类群。依据k=2时，利用Simulation Result中的bar plot，可以绘制得到k=2时各品种在群中所占基因型的比例图。研究表明，2个类群分别用2种颜色来表示，两种颜色分别描述不同品种被分到这2类群中基因型所占比例，红色部分较绿色部分比例大一些，表明划分到红色类群的品种材料较多一些。图1，图2

Y轴为△k、X轴为K向日葵群体结构分群数目

Numbers on y-axis show the △Kand numbers on x-axis showKbelongs to sunflower populations

图1 利用△K对向日葵群体结构优化曲线
Fig.1 Bilateral charts(△K)to access the optimal construction of populations in studied sunflower

Y轴显示所在群向日葵个体的相关系数， X轴为所在群的日葵个体

Numbers on y-axis show the membership coefficient to sub-populations and numbers on x-axis show the individual code belongs to sunflower populations

图2 利用Structure软件分析向日葵群体分群
Fig.2 The construction of sunflower populations using Structure software

2.3 参试材料的聚类分析

利用62对列标签位点多态性SSR标记对136份向日葵资源材料进行基因型鉴定，其中数字1为有带、0为无带，缺失为999。部分标记的136份材料的扩增效果，研究表明，PCR扩增图像清晰，条带易读。NTSYS-pc2.10软件对136份基因型数据分析的聚类树状图见图 3。依据△K=2，在0.65 相似系数水平上136 份向日葵品种资源可聚为2大群。其中第1大群有67份，其材料号分别为：1、2、42、67、5、128、75、7、8、93、15、19、22、20、21、9、110、120、27、69、70、76、100、105、87、128、13、35、36、55、41、48、49、32、18、121、122、45、46、123、47、40、61、71、64、52、58、73、43、44、50、33、34、53、57、116、56、66、37、63、59、60、38、39、80、97、108。

第2大群有50份，其材料号分别为：4、106、109、112、14、29、113、101、104、111、107、16、91、127、92、132、133、96、103、135、136、102、88、90、125、126、94、23、54、24、68、114、25、65、26、30、31、17、77、118、85、99、51、124、62、115、72、130、74、79。另有19份未分配到任何群中，其材料号分别为：10、82、83、11、12、84、129、134、117、78、81、86、89、95、98、119、3、6、131。以上分群显示参试材料在群体1和群体2中包含的材料数目比较均衡，表明这些群体材料的遗传多样性代表性较好。

从聚类分析可以看出，材料77和118基因型相似性为100%，125和126基因型相似性为100%，应该为同一材料。其中基因型相似性系数达90%以上的分别有：77、118和85之间；106和109之间；82和83之间；38和39之间；40和6之间；45、46和47之间。这些相似性高的育种材料在今后向日葵自交系基因型改良育种时要尽量避免互相杂交。

73份油葵自交系材料中，有51份被划分到第1大群，占比70%，17份被划分到第2大群，3份不能划分到任何一群。表明参试油葵自交系资源材料主要归属于第1大群。参试的30份油葵保持系中只有4份保持系归属到第2大群，其余保持系均在1大群。而在43份油葵恢复系中有25份划分到第1大群。研究表明参试的油葵恢复系材料分群较保持系分群分散，暗示其遗传多样性较保持系丰富。在55份食葵自交系中，有12份被划分到第1大群，占比21%，有29份划分到第2大群，研究表明参试食葵资源材料主要归属于第2大群。其中 20份食葵保持系中有3份被划分到第1大群，14分到第2大群。35份恢复系中有9份划分到第1大群。在第在未划分到任何群的材料中油葵材料有3份，其余13份材料为食葵。8份油葵杂交种有4份划分到第1大群，另4份划分到第二大群。研究表明参试油葵资源材料主要属于第1大群，其恢复系遗传多样性较保持系丰富。而参试食葵材料主要属于第2大群，食葵的遗传多样性较油葵的遗传多样性丰富，同时新疆食葵和油葵资源材料间有部分基因相互交叉渗透。图3～6

(第一大群)(续下页)

图3 136份新疆向日葵资源材料树状聚类图

Fig.3 The tree dendrogram of 136 population of Xinjiang sunflower materials

注：从左到右为标准DNA分子量以及标记ORS 671在1-136号向日葵材料扩增结果

Note: The Lanes from left to right were molecular weight bands and the products of PCR replication of ORS671 in 136 sunflower materials

图4 ORS671标记在136份向日葵材料中的扩增效果
Fig.4 The products of replication of ORS671 in 136 sunflower materials

注：从左到右为标准DNA分子量以及标记ORS 679在1-136号向日葵材料扩增结果

Note: The Lanes from left to right were molecular weight bands and the products of PCR replication of ORS679 in 136 sunflower materials

图5 ORS679标记在136份向日葵材料中的扩增效果
Fig.5 The products of replication of ORS679 in 136 sunflower materials

注：从左到右为标准DNA分子量以及标记ORS 687在1-136号向日葵材料扩增结果

Note: The Lanes from left to right were molecular weight bands and the products of PCR replication of ORS687 in 136 sunflower materials

图6 ORS687标记在136份向日葵材料中的扩增效果
Fig.6 The products of replication of ORS687 in 136 sunflower materials

3 讨 论

3. 1 向日葵自交系种质类群的划分

研究向日葵育种材料的遗传多样性和亲缘关系，对于提高其自交系的利用效率有着重要意义。以往研究表明利用界内认可的标准系可以有效地将不明系谱关系的自交系划分到相应的种质类群中。这种不同种质类群的划分，对杂种优势利用有着重要的参考意义。由于向日葵缺乏相应的标准系，国内对向日葵群体的种质类群的划分通常依据个人经验，不同研究报道其群体的遗传多样性划分也不尽相同，人为因素影响较大。研究选用136份向日葵种质群体, 利用structure软件分析了向日葵群体基因型，依据△K的变化，将新疆向日葵自交系材料群体划分为2大类群，这为今后选配新杂交组合提供了理论依据。这与李艳花报道[20]在0.69 相似系数水平上分为 5 类，以及胡小利报道[21]在遗传相似系数为0.62时将参试品种被划为4种类群不同。

向日葵群体遗传结构研究方面，Mandel等[14]将向日葵栽培种主要分为两个群体。Marjan等[15]对收集到的50份食用向日葵的群体结构分析表明，食用向日葵可以分为三大群。Filippi[16]等利用 137份向日葵自交系、13个开放授粉材料和20个复合品种的群体结构表明，SNP标记可以将群体划分2两群，而SSR标记可以将群体划分3群。上述研究向日葵分群与研究向日葵分群数目有相同也有异同。由于不同向日葵栽培地区其育种研究方向的差异，如前苏联选育的优良向日葵品种多为高含油量、高产量、高抗病虫为特点；法国较为重视选育茎秆矮小、分枝多和抗旱性强的向日葵新品种；美国育种家多重视选育抗病、抗倒伏、抗杂草等优良向日葵杂交种。其次不用研究报道所利用的向日葵的资源材料丰富度也有差异。这些都可能对向日葵资源材料分群有一定的影响。

3.2 遗传聚类结果比较

食葵资源材料的遗传多样性大于油葵资源材料间的遗传多样性，同时食葵和油葵资源材料间有部分相互交叉渗透。造成油葵资源材料间的遗传多样性小食葵的原因可能与新疆油葵育种家长期一味追求油葵高产育种目标相关，长期对油葵自交系材料的高产性状的选择会造成其它丰富基因的流失，导致油葵品种对外界环境的压力的敏感，从而可能造成油葵潜在病虫害爆发的危险。因此研究结果不仅可以帮助了解新疆向日葵种质的遗传多样性及其差异情况，了解向日葵种质的更新进程，为新疆向日葵育种研究提供理论依据。

4 结 论

研究参试的136份向日葵群体基因型依据△K的变化，可以分为2大类群。其中73份油葵自交系材料中，70%自交系材料被分配到第1大群。30份油葵保持系中只有4份保持系被分配到第二大群，其余保持系均在1大群。而在43份油葵恢复系中有25份分配到第1大群，其余分配到其它群中。在55份食葵自交系中，仅有21%食葵被分到第1大群。参试食葵品种的遗传多样性较油葵的遗传多样性丰富，食葵和油葵资源材料间有部分基因相互交叉渗透。

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Supported by:The Yuanjiang project of Science and technology Corps"Study on breeding techniques with rapid and efficient and Germplasm Resources Innovation of sunflower" (2014AB007); The project of national Industrial technology system of sunflower (CARS-16)

Study on the Population Structure and Cluster Analysis of Some Sunflower Inbred Lines in Xinjiang by SSR Markers

LIU Sheng-li1, DUAN Wei2, WANG Peng1, LIU Yan-Tao1, WANG Pei-zheng3

(1.XinjiangAcademyofAgriculturalReclamationSciences,ShiheziXinjiang832000,China;2.XinjiangKangdiSeedScience&TechnologyCo.Ltd,Urumqi830011,China;3.HainanTropicalOceanUniversity,SanyaHainan572022,China)

【Objective】 Sequence Tagged Site (STS) is a short DNA sequence, which appears only once on its biological chromosome and is suitable for a landmark of crop genome.【Method】500 STS-SSR primers of sunflower were synthesized randomly and were used to screen the samples of Xinjiang edible sunflower and oil sunflower inbred lines for finding the polymorphism.【Result】All of them 62 markers showed stable polymorphism among those 136 sunflowers with clear, stable and easy to read characteristics, which accounted for 12.4% of the number of selected primers. 136 Xinjiang sunflower inbred populations could be divided into 2 groups according to the change of △Kand be clustered into 2 groups at the 0.65 similarity level. In the 73 oil sunflower inbred lines, 70% inbred lines were assigned to first groups which meant the oil sunflower inbred lines were mainly classified in the first group. Among 30 maintainer lines of oil sunflower lines only 4 maintainer lines were assigned to second groups, the rest were in group I. In the 43 restorer line of oil sunflower, 25 restorer lines were allocated to first large groups, and the rest were allocated to other groups, which indicated that the genetic diversity of restorer line was more abundant than maintainer lines. In the 55 edible sunflower inbred lines, only 21% of them were divided into first groups which indicated that edible sunflower inbred lines belonged to the second and the third groups.【Conclusion】This study showed that the genetic diversity of edible sunflower was greater than that of oil sunflower, and some genes between the edible sunflower and oil sunflower materials were crossed and penetrated. The results of this study have provided theoretical support for the construction of the core collection and the rational utilization of resources in the future.

sunflower; sequence tagged site; population structure; cluster analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.004

2016-10-07

兵团科技支疆项目“向日葵快速高效选育技术及种质资源创新研究”(2014AB007)；国家向日葵现代产业技术体系建设项目(CARS-16)

刘胜利(1967-)，男，山东宁津人，硕士，研究员，研究方向为向日葵新品种选育与栽培，(E-mail)liushenglilsl@163.com

王沛政(1972-)，男，陕西人，副教授，研究方向分子遗传育种，(E-mail)condywpz@126.com

S565.5

A

1001-4330(2017)02-0223-11