一种高选择性的硫化氢比率探针

丁 静, 葛海燕, 葛燕青, 王玉民, 李艳玲

(1. 泰山医学院 化工学院, 泰安 271016; 2. 泰山医学院 生命科学学院, 泰安 271016)

一种高选择性的硫化氢比率探针

丁 静1, 葛海燕1, 葛燕青1, 王玉民1, 李艳玲2

(1. 泰山医学院 化工学院, 泰安 271016; 2. 泰山医学院 生命科学学院, 泰安 271016)

近些年来的研究表明,硫化氢(H2S)作为继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三种气体信使分子[1-2],在生物体的各种生理、病理过程中都起着重要的作用,比如调控炎症、控制血压、调节神经递质等[3-4]。此外,细胞内H2S含量的变化还会引起一些疾病,如阿尔茨海默症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化[5-7]。因此,发展具有高选择性和高灵敏度检测H2S的方法具有重要意义,并能为学术研究和临床应用提供有用的信息。

目前,主要的检测H2S方法有电化学分析法、分光光度法、化学发光法和气相色谱法[8-12]等。分子探针由于具有选择性高、灵敏度高、操作简便和能实时原位检测等优势[13-14],近年来受到人们的广泛关注。而这些探针大多是以单波长荧光强度变化进行检测,这种方法有着自身不可克服的缺点,即在定量分析时易受到多种因素的影响,如探针的稳定性、浓度,待测试体系的酸度、温度,检测仪器的稳定性等,致使分析结果的准确度下降。而比率探针在与目标分析物作用时自身能够产生两个不同波长的荧光,基于两波长处荧光强度或吸收强度的比值随目标分析物的浓度改变而变化来定量检测目标分析物。由于两波长处强度相对变化的自参比作用能够有效地消除其他因素的干扰,比率探针定量检测的准确度更高[15-16]。本工作基于H2S和C=C之间的亲核加成反应设计合成一种新的H2S比率探针,其合成及其与H2S作用机理见图1。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津UV-2450型紫外-可见分光光度计;Bruker 400 MHz型核磁共振仪;岛津LC-MS 2010A型液相色谱-质谱联用仪;pHS-25B型pH酸度计。

图1 H2S探针的合成及作用机理Fig. 1 Synthesis and proposed mechanism of the probe for H2S

所用试剂均为分析纯,试验用水为超纯水。

1.2 探针的合成

称取碘化1,2-二甲基吡啶盐0.235 g(1.0 mmol)和4-硝基苯甲醛0.31 g于50 mL圆底烧瓶中,加入正丁醇20 mL,加催化剂用量哌嗪,混合溶液加热至回流,反应40 min。将反应溶液冷却至室温,待大量固体析出,减压抽滤,用正丁醇重结晶,得0.230 g橘红色固体,产率62.5%。核磁共振和质谱表征表明产物为探针碘化1-甲基-2-(4-硝基)苯乙烯基吡啶盐。

1.3 试验方法

称取探针0.003 7 g溶于二甲基甲酰胺中,转移至100 mL容量瓶中,用二甲基甲酰胺定容,配成1.0×10-4mol·L-1溶液。在若干10 mL比色管中加入探针溶液1.00 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液100 mL、不同体积(0～700 μL)的0.01 mol·L-1Na2S溶液,用水定容至10 mL。放置10 min,测定其紫外-可见吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱特性

在pH 7.4的PBS缓冲溶液中,10 μmol·L-1的探针及其与不同量的Na2S作用后的紫外-可见吸收光谱见图2。

曲线1～11所对应的Na2S的浓度分别为0,50,100,200,300,400,450,500,550,600,700 μmol·L-1图2 探针(10 μmol·L-1)与不同量的Na2S作用后的紫外-可见吸收光谱Fig. 2 UV-vis absorption spectra of probe (10 μmol·L-1) reacting with different amount of Na2S

由图2可知:没有加入Na2S时探针在339 nm处有较强吸收,当加入不同量的Na2S时,探针在339 nm处的吸收带逐渐降低,而在244 nm处出现一个新的吸收带且逐渐增强。这一现象表明加入Na2S后,H2S与探针分子中的C=C发生了加成反应,导致整个探针分子的共轭程度降低使吸收峰发生蓝移。

2.2 探针与硫化氢的反应机制

为了理解探针和H2S的作用机理,在pH 7.4的PBS缓冲溶液中,将加入Na2S的探针溶液进行质谱分析。结果发现化合物1的m/z=402。因此,最有可能的反应机制见图1中的加成反应。

2.3 反应时间的选择

响应时间是一个重要的因素,特别是在生物体系内的快速代谢。探针在加入Na2S后吸收强度比(A244 nm/A339 nm)随反应时间的变化曲线见图3。

图3 探针(10 μmol·L-1)加入Na2S(400 μmol·L-1)后吸收强度比(A244 nm/A339 nm)随时间的变化Fig. 3 Absorption intensity ratio (A244 nm/A339 nm) of probe (10 μmol·L-1) over time after the addition of Na2S (400 μmol·L-1)

由图3可知:反应刚开始时吸收强度比(A244 nm/A339 nm)迅速增加,在6 min之后吸收强度比变化很小,8 min后探针和Na2S的反应已经基本完成。试验选择探针与Na2S反应10 min之后进行测定。

2.4 灵敏度测试

试验考察了探针对不同浓度Na2S溶液作用后的吸收强度比,结果见图4。

图4 探针的吸收强度比(A244 nm/A339 nm)与Na2S浓度的关系Fig. 4 Relationship between absorption intensity ratio(A244 nm/A339 nm) of probe and Na2S concentration

由图4可知:随着Na2S的浓度从0增加至700 μmol·L-1,探针的吸收强度比(A244 nm/A339 nm)与Na2S浓度呈线性关系,线性回归方程为A244 nm/A339 nm=0.001 2c+0.178 4,相关系数为0.993 5,检出限为13 μmol·L-1。因此,探针可定量测定H2S。

2.5 选择性试验

选择性是评价一个探针性能的重要参数。试验考察了K+、Cl-、Mg2+、SO42-、NO2-、谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)和谷氨酸(Leu)对检测的影响,结果见图5。

曲线1～10所对应的分析物分别为K+、Cl-、Mg2+、SO42-、NO2-(1 200 μmol·L-1);GSH、Cys、Glu、Pro、Leu(800 μmol·L-1)图5 在pH 7.4的PBS缓冲溶液中探针对不同分析物的紫外-可见吸收光谱Fig. 5 UV-vis absorption spectra of probe toward various analytes in PBS with pH 7.4

由图5可知,探针对H2S具有很好的选择性。半胱氨酸和谷胱甘肽作为还原性硫醇分子,可能对探针检测H2S的选择性造成较大影响,但是,结果显示半胱氨酸和谷胱甘肽对探针几乎没有影响,这可能是因为半胱氨酸和谷胱甘肽比H2S有更大的空间位阻效应。因此,探针可用于生理条件下的H2S检测。

2.6 合成样品分析

在试验条件下对含干扰物质的H2S合成样品进行测定,结果见表1。结果表明,本方法适用于H2S的检测。

本工作基于H2S和C=C之间的亲核加成反应设计并合成了一种H2S比率探针。探针与H2S的响应速率较快(8 min内完成)且对H2S具有很高的选择性,不易受常见离子和还原性硫醇的影响,具有较高的灵敏度。

表1 H2S合成试样测定结果(n=3)Tab. 1 Determination results of synthetic H2S samples

[1] LI L, ROSE P, MOORE P K. Hydrogen sulfide and cell signaling[J]. Annu Rev Pharmacol, 2011,51(1):169-187.

[2] KABIL O, BANERJEE R. Redox biochemistry of hydrogen sulfide[J]. J Biol Chem, 2010,285(29):21903-21907.

[3] NICHOLSON C K, CAIVERT J W. Hydrogen sulfide and ischemia-reperfusion injury[J]. Pharmacol Res, 2010,62(4):289-297.

[4] ABE K, KIMURA H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulator[J]. J Neurosci, 1996,16(3):1066-1071.

[5] YANG W, YANG G D, JIA X M, et al. Activation of KATP channels by H2S in rat insulin-secreting cells and the underlying mechanisms[J]. J Physiol, 2005,569(2):519-531.

[6] ETO K, ASADA T, ARIMA K, et al. Brain hydrogen sulfide is severely decreased in Alzheimer's disease[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002,293(5):1485-1488.

[7] DING J, GE Y Q, ZHU B C. A highly selective fluorescent probe for quantitative detection of hydrogen sulfide[J]. Analytical Sciences, 2013,29(12):1171-1175.

[8] LAWRENCE N S, DEO R P, WANG J. Electrochemical determination of hydrogen sulfide at carbon nanotube modified electrodes[J]. Anal Chim Acta, 2004,517(1/2):131-137.

[9] DOELLER J E, ISBELL T S, BENAVIDES G, et al. Polarographic measurement of hydrogen sulfide production and consumption by mammalian tissu[J]. Analytical Biochemistry, 2005,341(1):40-51.

[10] 郑扬,廖锋,杜军保,等.改良亚甲基蓝法测定血浆硫化氢[J].生理学报, 2012,64(6):681-686.

[11] ZHAO Y Z, ZHU X H, KAN H, et al. A highly selective colorimetric chemodosimeter for fast and quantitative detection of hydrogen sulfide[J]. Analyst, 2012,137(10),5576-5580.

[12] 刘春霞,马兴,魏国华,等.一种基于荧光素的高选择性硫化氢荧光探针[J].环境化学, 2014,33(10):1762-1767.

[13] VALEUR B. Molecular fluorescence: principles and applieations [M]. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH, 2001:273-350.

[14] CALLAN J F, DE SILVA A P, MAGRI D C. Lumineseent sensors and switehes in the early 21st century[J]. Tetrahedron, 2005,61(36):8551-8588.

[15] XUE L, LIU Q, JIANG H. Ratiometric Zn2+fluorescent sensor and new approach for sensing Cd2+by ratiometric displacement[J]. Organic Letters, 2009,11(15):3454-3457.

[16] XU Z C, YOON J, SPRING D R. A selective and ratiometric Cu2+fluorescent probe based on naphthalimide excimer-monomer switching[J]. Chemical Communication, 2010,46(15):2563-2565.

10.11973/lhjy-hx201703020

2016-03-27

国家自然科学基金资助项目(81403036,31370575- 1);山东省医药卫生科技发展计划项目(2013ws0318)

O657.3

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1001-4020(2017)03-0342-04