生物催化合成中生物酶破碎过程温度与浓度对酶活的影响

何连顺，张仲良，米造吉，李斌水，马 静，马 腾

（氨基酸衍生物生物催化技术国家地方联合工程实验室（河北）精晶药业股份有限公司，河北石家庄 050000）

生物催化合成中生物酶破碎过程温度与浓度对酶活的影响

何连顺，张仲良，米造吉，李斌水，马 静，马 腾

（氨基酸衍生物生物催化技术国家地方联合工程实验室（河北）精晶药业股份有限公司，河北石家庄 050000）

生物体内均含有生物酶，生物酶既是生命活动的产物，又是生命必不可少的条件之一。具有生物催化功能的生物大分子（生物酶）在不同浓度和不同温度条件下，对各种各样的生化反应有重要的影响。无论酶的化学组成主要是蛋白质（蛋白类酶P-酶）还是核糖核酸（核酸类酶R-酶），作为催化剂与非酶催化相比，均有专一性强、催化效率高、条件温和等特点。通过对温度和浓度的对比研究，发现了对湿菌体氨基酸衍生物生物酶酶活的影响，当温度变化30℃或酶浓度增加3倍时，在相同的超声破碎条件下，酶活均降低90%以上，酶活衰减直接影响了氨基酸及其衍生物的催化功能。

生物酶；酶活；氨基酸；衍生物

生物酶催化合成技术作为生物化学的分支学科，在氨基酸及其衍生物工业应用上的主要作用是作为催化剂来起到转化、分解、加成、氧化还原等作用。生物酶分离纯化是将酶从细胞或其他含有酶原料中提取出来，再与杂质分开，以获得符合研究或使用要求的酶的过程。主要内容包括菌体破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶等[1]。

酶的种类繁多，已知的约有4 000多种[2]，它们存在不同生物体内的不同部位。对于不同的生物体，或同一生物体的不同组织细胞，由于结构不同、所处环境不同，破碎的方法和条件也有所不同，为了得到生物酶，必须根据酶的特性进行不同手段的处理，常规的破碎方法有机械破碎、化学破碎、酶促破碎等方式。机械破碎主要依托剪切力或温度、压力等物理因素的作用，使细胞破碎，包括高压均浆法、研磨法、超声波破碎等。化学破碎主要通过化学试剂改变细胞壁或膜的通透性，使内含物质释放出来，常用的试剂有酸碱、表面活性剂、丙酮、丁醇、吐温、特里顿等。酶促破碎主要是通过酶制剂或自身酶系的作用，是细胞外层结构受到破坏，达到细胞破碎的目的。常用的溶菌酶、糖苷酶、蛋白水解酶、酯酶、纤维素酶、果胶酶等。

酶的活性对于工业过程生产率至关重要，在破碎的同时要保障酶活，通常单位酶活是最重要的参考指标，即1g湿菌体酶所在对应温度条件下，每分钟生成1μmol产物所需酶量，单位为IU/g。生物催化相比传统化学方法的优势人们人事已久，但直到近年来才突飞猛进[3]。本课题将重点检测在不同温度和湿菌体浓度下采用超声波破碎，检测温度对酶活的影响。

1 仪器与试药

JY92-IID型超声波细胞破碎仪（宁波立诚仪器有限公司）；安捷伦1260高效液相（日本Agilent technologies 公司）、生物湿菌体（精晶药业股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 处理方法

将生物湿菌体用PBS缓冲液溶解，考虑到实际应用过程中环境的控制手段和实际可操作性，分别按照以下编号条件下进行超声破破碎，生物湿菌体分别在不同温度、不同浓度条件下先稳定15min，之后进行超声破碎，破碎功率800W：破碎3s，间隔2s，如此连续操作15min，之后分别将A-1～A-4所得酶液保存在（10±1）℃条件下放置1h检测酶活，将B-1～B-4所得酶液保存在（30±1）℃条件下放置1h检测酶活。

表1 A/B两组实验条件

2.2 酶活检测方法

用同样底物浓度的原料体系50mL，浓度5%，分别加入A-1～B-4湿菌体量的酶液5mL，催化转化10min，检测产物生成量，根据公式计算可得酶活。

2.2.1 色谱条件

色谱柱：氨基键合硅胶柱，4.6mm×250mm，5μm流速：1.0mL/min

检测波长：205nm

柱温：30℃进样体积：20μl

流动相：称13.6g磷酸二氢钾、1.05g庚烷磺酸钠至1 000ml量瓶中，加1 000ml纯化水溶解后加52ml乙腈，混匀，过滤，超声脱气。

2.2.2 待测样品制备

精密量取上述待测酶液1ml至10ml量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，过滤进样；

精密量取空白溶液0.5ml至50ml量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，过滤进样，记录色谱图至15min。

2.2.3 酶活计算

式中：

W1：对照品的质量，（mg）；

S：对照品的含量；

A1：生成产物的面积；

A0：空白中产物的面积；

n1：酶液稀释倍数；

50：反应体系；

W2：湿菌体的质量，（mg）；

AST：产物对照品的面积；

n2：产物对照品的稀释倍数；

M：产物的分子量；

10：反应时间，（min）。

2.3 结果及分析

根据以上条件，跟踪检测结果，经计算可得表2：

为了更好的体现在不同浓度和不同温度下，酶活变化情况，根据以上数据，做成曲线图，见图1和图2：

表2 AB两组实验结果

图1 A组实验结果

图2 B组实验结果

由以上可以看出，在实际应用操作环境下两组对照试验的趋势是一致的，当酶浓度在10%时，在温度10℃条件下，进行超声波破碎，酶活浓度最高，当温度升高到40℃时，生物湿菌体酶酶活降低90%以上，提高酶浓度到30%，现象一致，即表明，湿菌体酶活衰减湿菌体比较合适的浓度为A-1条件。

3 讨论

通过A/B两组实验不难看出，湿菌体的破碎受浓度和温度的影响，在较低温度下，能很好的保持酶的活性，随着温度的升高和酶浓度的升高，破碎均造成了酶活的降低，可能原因是生物酶自身发生了断裂或三维立体结构发生了改变，这种改变在高浓度是表现比较明显，也有可能是温度的升高造成了酶蛋白或者酶核酸发生了变性，最终体现出酶活的降低。

[1] 郭勇，郑惠平.酶学[M].广州.华南理工大学出版社，2000.

[2] Tao Junhua .Biocatalysis for the PHarmaceutical industry.John wiley &sons（Asia）Pte Ltd.2009.

Effects of Temperature and Concentration on Enzyme Activity in Biological Process of Biocatalytic Synthesis in Biocatalytic Synthesis

He Lian-shun，Zhang Zhong-liang，Mi Zao-ji，Li Bin-shui，Ma Jing，Ma Teng

Biological organisms contain both biological enzymes，biological enzymes is the product of life activities，but also one of the essential conditions of life.The biological macromolecules（biological enzymes）with biocatalytic function have important effects on various biochemical reactions under different concentration and temperature conditions.Whether the chemical composition of the enzyme is mainly protein（proteinase P-enzyme）Or ribonucleic acid（nucleic acid enzyme R-enzyme），as a catalyst and non-enzyme catalysis compared to have specificity，high catalytic efficiency，mild conditions and so on.In this experiment，we studied the effects of temperature and concentration on the activity of the enzyme of the amino acid derivatives of the wet bacteria.When the temperature was changed by 30 ℃ or the enzyme concentration was increased by 3 times，under the same ultrasonic crushing conditions，The average activity decreased by more than 90%，and the decay of enzyme activity directly affected the catalytic function of amino acids and their derivatives.

biological enzyme；enzyme activity；amino acid；derivative

Q814

B

1003-6490（2017）01-0130-02

2017-01-18

何连顺（1987—），男，河北石家庄人，工程师，主要从事于生物酶催化合成技术、高分子材料合成及应用技术、结晶技术等工作。