牡丹多糖的提取及其对自由基和亚硝酸根离子的清除作用

2017-04-12黄海霞孙丽蓉司晓磊郁飞燕

河南农业科学 2017年4期

关键词：正丁醇清除率牡丹

黄海霞，孙丽蓉，司晓磊，郁飞燕

(河南科技大学农学院，河南洛阳 471023)

牡丹多糖的提取及其对自由基和亚硝酸根离子的清除作用

黄海霞，孙丽蓉，司晓磊，郁飞燕

(河南科技大学农学院，河南洛阳 471023)

牡丹；多糖； Sevage法；自由基；亚硝酸根

1 材料和方法

1.1 材料来源与处理

牡丹根于2012年11月采自洛阳国际牡丹园。将牡丹根洗净后抽去其髓部，置于烘箱内30 ℃烘干，用粉碎机将其粉碎，过筛孔内径为420 μm的金属筛。再将牡丹根粉末于35 ℃条件下恒温干燥12 h，密封保存在棕色试剂瓶内备用。

1.2 方法

1.2.1 牡丹多糖的制备工艺

1.2.1.1 牡丹多糖提取工艺流程牡丹根粉末→乙醚脱脂→10.00 g脱脂后粉末，加入200 mL蒸馏水，80 ℃水浴3 h后过滤→10 mL滤液中加入Sevage试剂(氯仿和正丁醇按一定比例混合)去蛋白→恒温振荡器上高速振荡25 min后置入分液漏斗内，静置30～45 min→取上清液进行真空干燥至1/3体积→加等体积95%乙醇，静置过夜→6 000 r/min离心20 min，弃上清→洗涤晶体，真空干燥。

1.2.1.2 Sevage法脱蛋白优化由于牡丹根中含有粗脂肪和蛋白质，要得到纯度较高的多糖，脱脂、脱蛋白的操作就显得十分重要。以蛋白质清除率为指标，分别考察Sevage试剂中氯仿与正丁醇体积比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、提取液与Sevage试剂体积比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)对脱蛋白效果的影响。

1.2.2 牡丹根中粗脂肪、蛋白质及多糖含量的测定粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法的残重法[8]。利用考马斯亮蓝G-250法[8]测定蛋白质含量，以小牛血清白蛋白为标准物质，蛋白质标准曲线方程为y=145.67A595(R2=0.993 6)，根据牡丹根多糖溶液去蛋白前后的蛋白质含量计算蛋白质清除率，以确定最佳的脱蛋白方法。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[9]，以葡萄糖作标准物，多糖标准曲线方程为y=155.32A490(R2=0.997 3)。

1.2.3.1 DPPH自由基清除率的测定精确移取不同质量浓度牡丹多糖溶液2 mL于试管中，再加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液，摇匀，室温放置30 min，测定波长517 nm处的吸收值，即为A样品(将2 mL乙醇与2 mL样品溶液混匀后作为空白调零)。2 mL乙醇和2 mL DPPH溶液混匀后测定A517，即为A对照。

清除率=(A对照-A样品)/A对照×100%。

1.3 数据处理

数据采用Excel 2007 统计处理。

2 结果与分析

2.1 牡丹根中主要物质组成

由图1可知，粗脂肪、蛋白质和多糖3种物质总量高达47%，其中多糖在牡丹根中含量相对较高，约占29%，粗脂肪与蛋白质所占比例相对低些。

2.2 Sevage法脱蛋白工艺的最佳方案

由表1可知，当Sevage试剂的加入量一定时，随着Sevage试剂中氯仿与正丁醇体积比的增加，蛋白质清除率先增大后减小，呈“几”字型变化，当二者体积比为3∶1时，蛋白质清除率最大，达到11.8%。

在Sevage试剂中氯仿与正丁醇体积比为3∶1的条件下，测定多糖提取液与Sevage试剂体积比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1时的蛋白质清除率，结果显示，蛋白质清除率随体积比增加而增加，当体积比从3∶1增加到4∶1时，蛋白质清除率增加1.2倍，从4∶1增加至5∶1时，蛋白质清除率仅增加了6.1%。综上所述，运用Sevage法去除多糖提取液中蛋白质的最佳方案为：氯仿与正丁醇体积比为3∶1，提取液与Sevage试剂体积比为4∶1。

图1 牡丹根中各组分含量分布表1 不同处理的蛋白质清除率

项目V氯仿∶V正丁醇(Sevage试剂)2∶13∶14∶15∶1V提取液∶VSevage试剂2∶13∶14∶15∶1蛋白质清除率/%4.111.86.65.93.05.211.412.1

2.3.1 DPPH自由基清除率由图2所示，不同质量浓度的牡丹多糖溶液对DPPH自由基有不同程度的清除效果。随着多糖溶液浓度的增加，DPPH自由基的清除率也增加。多糖质量浓度在0～1.0 g/L时，DPPH自由基的清除率变化明显，随浓度增加清除率迅速增大。当多糖质量浓度高于2.5 g/L时，清除率变化基本已达到稳定状态；高质量浓度(10.0 g/L)下，DPPH自由基的清除率可达68.97%。因此，当多糖溶液质量浓度为2.5 g/L时对DPPH自由基的清除效果较好。

图2 不同质量浓度多糖溶液对DPPH自由基清除率的影响

图3 不同质量浓度多糖溶液对·清除率的影响

图4 不同质量浓度多糖溶液对清除率的影响

3 结论与讨论

本研究通过脱脂、Sevage试剂去蛋白、多糖的浓缩、沉淀及洗涤等一系列操作，成功制备出牡丹多糖晶体，确定去蛋白的最佳方案为：Sevage试剂中氯仿与正丁醇体积比为3∶1，多糖提取液与Sevage试剂添加量体积比为4∶1。这一结论与扈瑞平等[13]的结果相吻合，但蛋白质清除率与其结果相比偏低。同时本试验结果表明，牡丹根中物质组成大致为粗脂肪含量为6%、蛋白质含量为12%，多糖含量较为丰富，约为29%。

[1] 付瑞燕，樊美珍．氧自由基清除剂的应用[J]．生物学杂志，2002，19(4)：31-33.

[3] 严榕，傅昌年，周朝辉.植物乳杆菌对亚硝酸根离子的清除作用[J].食品工业，2003(6)：40-41.

[4] 刘亚丽，刘蕾，王荣峰．STS、PP333对牡丹切花保鲜及某些生理特性的影响[J]．吉林农业大学学报，2005，27(3)：276-279.

[5] 吴少华，马云保，罗晓东，等．丹皮的化学成分研究[J]．中草药，2002，33(8)：679-680.

[6] 张虹，丁安伟，张丽．中药牡丹皮的研究进展[J]．江苏中医药，2007，39(9)：124-127.

[7] 汪志好．植物多糖的研究进展[J]．安徽卫生职业技术学院学报，2007，6(2)：86-88.

[8] 王宪泽．生物化学实验技术原理和方法[M]．北京：中国农业出版社，2008.

[9] 王玮．苯酚-硫酸法测定猕猴桃根中多糖的含量[J]．药学进展，2010，34(5)：225-227.

[10] 黄海霞，张亚坤，张丹丹，等.芍药花粉提取物的抗氧化能力研究[J].河南农业科学，2012，41(11)：117-120.

[11] 黄海霞，侯宇清.不同品种牡丹抗氧化能力与其多酚黄酮含量的关系研究[J].时珍国医国药，2010，21(11)：2921-2923.

[12] 赵金伟，李范洙，张先.苹果梨酚类物质抗氧化活性研究[J].食品科学，2010，31(17)：170-172.

[13] 扈瑞平，张兴夫，杜玲，等.沙葱多糖Sevage法除蛋白工艺的研究[J].内蒙古农业大学学报，2009，40(6)：658-662.

[14] Jeddou K,Chaari F,Maktouf S,etal.Structural,functional,and antioxidant properties of water-soluble polysaccharides from potatoes peels[J].Food Chemistry,2016,205:97-105．

Extraction of Polysaccharide from Peony and Its Scavenging Effects on Free Radicals and Nitrite Ion

HUANG Haixia,SUN Lirong,SI Xiaolei,YU Feiyan

(Agricultural College,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)