粒细胞集落刺激因子免疫调节胚胎植入的研究进展

温惠慧，纪亚忠

(同济大学附属同济医院生殖医学科，上海 200065)

粒细胞集落刺激因子免疫调节胚胎植入的研究进展

温惠慧，纪亚忠*

(同济大学附属同济医院生殖医学科，上海 200065)

免疫因素介入的反复种植失败和复发性流产是导致不孕不育的常见原因之一。近年来，应用粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-Colony Stimulating Factor，G-CSF)改善子宫内膜容受性，提高临床胚胎着床率、降低复发性流产逐渐成为相关研究热点。本文从其作用机制和临床应用两个方面对G-CSF在辅助生殖医学中的最新研究进展，进行了综述。

粒细胞集落刺激因子； 复发性流产； 反复种植失败

(JReprodMed2017，26(7)：730-734)

一、概述

成功妊娠的关键环节之一是胚胎成功着床。但目前，无论是自然妊娠还是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)，不明原因的胚胎着床失败(RIF)和复发性流产(RSA)发生率仍较高，研究表明其发病因素繁多，在排除遗传发育、生殖系统畸形、高育龄等因素后仍有部分女性患者无法成功受孕。早期妊娠失败，如RSA，林其德等[1]建议将RSA分为2类6型，即免疫类(同种免疫型和自身免疫型)和非免疫类(染色体异常型、解剖异常型、内分泌紊乱型、感染型)。对于成功妊娠免疫因素尤为重要，生殖道特别是子宫局部的免疫细胞能否识别并耐受胚胎抗原直接影响了妊娠的建立和维持。粒细胞集落因子(G-CSF)是正常妊娠生理过程中调节子宫内膜免疫细胞功能的重要细胞因子之一，在母体与胚胎之间的交流中有着重要的调节作用。妊娠，作为一种同种异体移植，不仅需要母体免疫系统不产生排斥作用耐受半同种移植物的胎儿，还需要早孕期细胞滋养细胞在该过程中发挥独特的生物学功能：如高增殖能力，甚至类似恶性肿瘤细胞的侵袭能力[2]。研究证实，G-CSF 可刺激自然移植物的细胞滋养细胞增殖并抑制其凋亡，在G-CSF 的作用下滋养细胞伪足增多、变长，侵袭能力增强[3]。因此G-CSF对母-胎界面具有双向调节作用，即对免疫细胞具有抑制作用，而对滋养细胞生物学功能则具有促进作用。

目前IVF-ET中单个移植周期的妊娠率约50%，累计妊娠率已达80%左右，但仍有近10%的女性患者经过多个周期种植后仍未受孕，通常称之为反复种植失败[4]。导致种植失败的原因除了胚胎本身质量外，子宫内膜容受性也起着关键作用。即使是高质量的胚胎，其胚胎植入率也仅有20%～30%左右[5]。研究已证明，G-CSF通过影响基因的表达调节子宫内膜血管重塑、局部免疫调控及细胞粘附系统，使其发生一系列改变，最终形成能够接受胚胎着床的一种综合状态，包括子宫内膜厚度、腔上皮、腺上皮、间质的发育状态及子宫内膜的血流灌注情况[6]。

二、G-CSF简介

1.G-CSF的来源及分布：G-CSF是常见的内源性造血生长因子，广泛作用于骨髓微环境，刺激血细胞再生。G-CSF可选择性促嗜中性粒细胞祖细胞增殖分化，通过促进吞噬氧化发挥其功能。1983年从小鼠体内首次发现并提纯了GSF，随后人源G-CSF(hG-CSF)于1986年克隆成功[7]。hG-CSF是一种小分子糖蛋白，包括 5个外显子和4个内含子，其分子量约为19 600，长约2.25 kd。G-CSF体内来源广泛，最早发现于造血细胞中的单核巨噬细胞系[8]，后发现血管内皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、血小板等非造血细胞及恶性肿瘤中也存在G-CSF及其受体的表达[9-10]。正常情况下，人体血清中G-CSF的含量很低，应激情况下可显著增高[11]。

2.粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的来源及分布：hG-CSF的生物活性通过细胞表面的特异性G-CSFR来调节。G-CSFR为高亲和力受体，主要存在于骨髓中，也表达在中性粒细胞、胎盘细胞、内皮细胞和髓系白血病细胞系如HL-60细胞等[12-13]。迄今为止，已发现5种不同类型的G-CSFR的异构体，由不同的RNA剪接方式产生，但各种变构体的生物学作用及其表达的调控目前仍不十分明确。G-CSF与血细胞表面G-CSFR结合发挥作用，刺激粒系母细胞增殖和分化，在增加成熟粒细胞功能的同时刺激骨髓造血干细胞增殖分化，并刺激骨髓细胞释放进入外周血。除了促进粒系母细胞生长增殖作用外，G-CSF也可促进损伤内膜中性粒细胞和单核细胞吞噬、运动、杀菌活性及表面分子的表达[14]。

三、G-CSF对胚胎种植与子宫内膜容受性的调节作用

1.滋养层细胞系细胞因子的表达与胚胎植入：胚胎来源的滋养层细胞向母体子宫内膜的迁移、浸润是正常胚胎植入以及胎盘形成的关键环节。由于G-CSFR主要存在于胎盘组织和滋养层细胞，因此推测G-CSF可能具有调节滋养层细胞和早期妊娠的作用[15]。有研究表明G-CSF通过激活PI3K/Akt和Erk1/2信号通路来提高人滋养层细胞系基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的活性以及血管内皮生长因子(VEGF)的分泌[16]。此外G-CSF还可通过以下机制和信号转导通路调节滋养层细胞系的迁移、侵袭，参与胚胎的植入：(1)G-CSF通过提高细胞运动性参与滋养层细胞迁移，将滋养层细胞置于含有G-CSF的培养基中孵化9 h，滋养层细胞出现前端伸出伪足、细胞体收缩、细胞尾端和周围基质黏着解离等迁移表型转变现象[3]；(2)细胞入侵过程中，整合素联系着胞外基质与肌动蛋白的α/β异二聚体膜受体，对细胞骨架重塑起着支配作用[17]。随着胎盘绒毛外滋养层细胞向母体子宫蜕膜层和肌层血管入侵时，细胞呈现α6β4整合素表达的下调，同时α5β1、αvβ1、αvβ3及α1β1整合素表达上调[18-19]。基于此，实验发现在含有G-CSF的培养基中，G-CSF可大大促进滋养层细胞β1亚基的表达，激活P38，Erk1/2和PI3K信号通路对β1整合素的表达进行调控[3]；(3) 促分裂素原活化蛋白激酶链(MAKP)是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，具有调控细胞增殖、分化、迁移及侵袭的生物学作用。MAPK主要有四个亚族：Erk、JNK、p38、Erk5。G-CSF通过PI3K介导的磷酸化作用活化滋养层细胞Erk1/2MAPK信号通路，调节MMP-2的活性和VEGF分泌[16]，同时也作用于p38信号通路[3]，从而促进滋养层细胞系的迁移、侵袭。以上实验表明G-CSF可作为母胎界面表达的因子之一促进胚胎植入和胎盘形成。

2.母体内膜淋巴细胞因子与胚胎植入：母体免疫系统功能受一系列细胞因子的调节，在胚胎种植过程中及妊娠早期，来自母体内膜淋巴细胞和胚胎滋养层细胞的多种因子参与了母体对胚胎免疫耐受的调节。子宫内膜中的 T 细胞主要分布于功能层，包含丰富的 T 细胞亚群。CD4+T 细胞激活后按分泌细胞因子谱分为 Th1 型和 Th2 型两个功能亚群。Th1 型细胞介导细胞免疫，主要分泌 白介素-2(IL-2)、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)等细胞因子。Th2 型细胞介导体液免疫，主要分泌 IL-4、IL-6、IL-10 等因子。大量研究表明Th1 型细胞介导的免疫应答不利于妊娠，而Th2 型细胞介导的免疫应答可以改善这种状态，正常妊娠是一种Th2 偏移现象[20]。体内外实验证实，G-CSF 可以诱导 CD4+和 CD8+T 细胞表达 G-CSFR，且呈时间依赖性；G-CSF 重复刺激能维持 G-CSFR在 CD4+T 细胞上的表达[21]，这可能是 G-CSF 对 T 细胞免疫调节的重要机制之一。G-CSF 抑制 T 细胞的异种反应性，使 T 细胞处于免疫低反应状态。G-CSF 可以诱导 T细胞的应答不足并促进T细胞由Th1 型向 Th2 型分化[22]。高明霞[23]研究发现，子宫内膜G-CSF可以激发G-CSFR的表达，IL-1、VEGFE、整合素β、白血病抑制因子、TNF-α等细胞因子的表达，降低IL-2的表达，从而促进内膜修复，改善子宫内膜容受性。

3.子宫内膜相关基因的表达与胚胎植入：将体外培养的子宫内膜细胞暴露于G-CSF环境中，探究与胚胎植入过程有关的子宫内膜相关基因表达的差异。结果提示G-CSF可通过影响以下基因的表达来调节子宫内膜血管重塑、局部免疫调控及细胞粘附系统：(1)TYMP，作为血小板衍化内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，其作用主要是通过调节整合素的表达促进血管形成及细胞迁移[24]。研究表明，在RIF和RSA患者的子宫内膜中，TYMPmRNA表达下调[25]；(2)磷酸化整合素B3 (ITGB3)是人和动物体内重要的子宫内膜黏附分子[26]，在大剂量的G-CSF培养基中体外培养子宫内膜组织，发现有大量ITGB3的表达，高度提示了该因子在细胞迁移及胚胎种植过程中的作用[27]，但RIF/RSA与对照组间无统计学意义[25]；(3)尿激酶型纤溶酶原激活物受体(PLAUR)，是细胞迁移、增殖分化、重塑组织的重要因子[28]，在不同月经周期子宫内膜中的表达存在动态差异，一般表达于早期胎盘组织，特别是子宫内膜自然杀伤细胞表面[29]。尿激酶纤维蛋白溶酶激活剂(uPA)表达高低与葡萄胎、先兆子痫等滋养层细胞相关妊娠疾病有关。其信号通路需要整合素，包括ITGB3的参与[28]。在RSA患者中发现，ITGB3/PLAURmRNA表达比值显著下降。而将子宫内膜暴露于含有大剂量G-CSF培养基中培养后，子宫内膜PLAUR mRNA表达显著提高，而在对照组中未发生明显变化[25]。故该实验表明可考虑将相关子宫内膜因子表达缺陷列入应用G-CSF适应症范畴。

四、G-CSF在生殖领域治疗现状

G-CSF在研究中主要用于治疗不明原因复发性流产、IVF-ET反复着床失败。

1.G-CSF应用于复发性流产：2009年Scarpellini 和 Sbracia[30]首次提出对患有RSA的夫妇使用基因重组的集落生长因子(rG-CSF)。该研究对前期静脉注射免疫球蛋白治疗失败的68名不明原因RSA的妇女进行随机对照试验。治疗组35位妇女经皮注射Filgrastim (Neupogen，Dompe，Italy)，治疗剂量 1 μg (100 000 IU)/kg/d。对照组33位妇女经皮注射生理盐水，治疗时间同治疗组。研究中所有妇女在三个月内均自然受孕。治疗组及对照组活产率分别为(82.8%：48.5%，P<0.01)。治疗组在孕期有相对较高水平的HCG。治疗组一例皮疹、两例白细胞增多(白细胞计数>25×109/L)，对照组一例妊娠高血压。两组在流产孕周和新生儿出生体重方面无差异且没有先天畸形病例报道。在23位流产患者中，对14位患者的妊娠组织进行基因检测，治疗组一例、对照组两例发现基因异常。

2013年，Santjohanser 等[31]对IVF且有RSA史的患者(至少有两次早期流产)进行G-CSF的有效性评估，127位患者共199个周期纳入研究。患者被随机分为三组：G-CSF治疗组，其他药物治疗组及对照组。所有研究对象均口服叶酸和阴道塞黄体酮栓剂(600 mg/d，黄体期开始至孕后12周)。结果显示采用G-CSF治疗组有较好的妊娠结局，妊娠率和活产率分别为47%、32%。与G-CSF治疗组相比，采用其他药物治疗组妊娠率和活产率分别为27%、14%，不采用药物治疗组妊娠率和活产率分别为24%、13%[31]]。两个实验采用不同的方案来评估G-CSF对RSA患者临床结局的有效性，均显示可降低流产率[30-31]。也有数据显示G-CSF参与了卵泡发育，可能是IVF结局的预测因子[32]。然而，使用G-CSF对何种症状是否真正有益依然有待探讨。

2.G-CSF应用于 IVF-ET反复着床失败：2011年Gleicher 等[33]首次报道应用rG-CSF治疗薄型子宫内膜，对4名不孕妇女(年龄在33～45岁)在胚胎移植当日通过宫腔内导管给药rG-CSF [30 MU (300 μg/1 ml)]。结果提示，用药后患者子宫内膜厚度显著增加且4例患者全部妊娠，除外一名异位妊娠。因此，胚胎移植当日，对于薄型子宫内膜患者，使用G-CSF 改善了患者妊娠率。

随后，2013年Gleicher 等[34]对21名IVF治疗失败(平均2.0±2.1 (0～9) 个周期)的患者(年龄为 40.5±6.5 岁)进行了超过18个月的前瞻性观察队列研究，部分患者诊断为卵巢储备功能下降 [16/21 (76.2%)]。这些患者HCG日的子宫内膜厚度均不超过7 mm。在HCG日的前6～12 h通过宫腔内导管注入G-CSF，若内膜在给药后的48 h内未增至7 mm，则在取卵后再次给药。其中3名患者需要再次给药。经阴道超声测量子宫内膜厚度。结果显示，从宫腔内灌注G-CSF到胚胎移植的过程中，内膜厚度自(6.4±1.4)mm增至(9.3±2.1)mm(P<0.01)并获得19.0%的临床妊娠率。结果表明，对于薄型子宫内膜患者，HCG日使用G-CSF 改善了患者妊娠率。虽然G-CSF对改善子宫内膜厚度有正向作用，但由于这项研究的局限性，例如小样本、无随机对照组以及入组病例未经严格筛选第一次行IVF治疗的不孕妇女，因此仍无法科学评价G-CSF对改善IVF临床妊娠率的有效性。

最近，Aleyasin等[35]对112名IVF反复着床失败的不孕患者进行多中心、随机对照实验，对G-CSF改善IVF临床结局的有效性进行评估。研究对象均采用长方案，在胚胎植入1 h前，治疗组56名患者皮下注射 300 μg G-CSF，对照组不采取任何治疗。黄体支持均采用天然黄体酮阴道栓剂 (2 次/d)以及80 mg阿司匹林。结果显示，治疗组及对照组移植率 (18% vs.7.2%，P=0.007)、生化妊娠率 (44.6% vs.19.6%，P=0.005)及临床妊娠率 (37.5% vs.14.3%，P=0.005)，治疗组明显高于对照组。该实验首次评估了全身性使用G-CSF对 IVF反复失败患者的有效性，与宫腔灌注相比，操作简单、易接受且成本更低。但因未建立对照组，尚需要更多的随机对照试验进行证实，并进一步探索其最佳临床应用途径与剂量。

五、总结

G-CSF作为预防RSA和RIF的新型免疫治疗方法之一，虽然其中的某些治疗方法可以有效提高临床妊娠率，但是仍需高质量的大样本随机双盲对照研究证明其有效性，进而明确真正受益的群体、最佳的给药剂量、给药时间、最佳给药途径(皮下还是宫腔灌注)，也亟待制定规范的治疗方案、严格的适应证及相关禁忌症。

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[编辑：谷炤]

Research progress in effect of granulocyte colony-stimulating factor on immune regulation in embryo implantation

WENHui-hui，JIYa-zhong*

DepartmentofAssistedReproduction，theaffiliatedTongjiHospitalofTongjiUniversity，Shanghai200065

It is a common cause of infertility that immune factors involve repeated implantation failure and recurrent abortion.In recent years，it is become a research hotspot that granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is applied for improving clinical embryo implantation rate，reducing recurrent miscarriage and improving endometrial receptivity.This paper reviews the latest research progress of application of G-CSF in assisted reproductive technology from two aspects of mechanism and clinical application.

G-CSF； Recurrent spontaneous abortion； Repeated implantation failure

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.07.022

2016-11-23；

2017-02-23

温惠慧，女，江西赣州人，硕士研究生，生殖医学专业.(*

，Email：jiyazhong@hotmail.com)