丁型肝炎病毒研究进展

李颖，张五星，周伟，王学军

1.中国人民解放军第309医院 肾脏内科，北京 100091；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850

丁型肝炎病毒研究进展

李颖1，张五星1，周伟1，王学军2

1.中国人民解放军第309医院 肾脏内科，北京 100091；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850

丁型肝炎病毒（HDV）是乙型肝炎病毒（HBV）的卫星病毒，呈世界性流行，其感染和复制与HBV感染存在密不可分的联系。我国是HBV感染的高发国家之一，HBV相关研究较多，但对其卫星病毒HDV的研究较少。我们较全面地梳理了HDV的分子生物学特征、流行病学特点、实验研究模型、检测、预防及治疗几个方面的最新进展，期望对未来HDV的研究起到一定的推动作用。

丁型肝炎病毒；慢性丁型肝炎；乙型肝炎病毒；研究进展

病毒性肝炎是指由嗜肝病毒感染引起的肝炎。目前人类肝炎病毒主要包括甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）和戊型肝炎病毒（HEV）等。全球约3.5亿人为HBV感染者，其中约1500万人为HDV共感染[1]。

我国是乙型病毒性肝炎高发的国家之一，总人口的7.18％是乙肝表面抗原（HBsAg）携带者，现已证明丁型病毒性肝炎存在及复制依赖于HBV，而且与单独的HBV感染相比，HBV和HDV共同感染会导致肝硬化的速度加快，及引发暴发性肝炎和肝细胞癌的发生[2-3]。所以我们在关注HBV的同时也应全面了解HDV。

1 HDV的分子生物学特征

HDV是Rizzetto等于1977年首次发现的，但被误认为是HBV的一种新型抗原抗体系统。后经过一系列试验，直至1984年才被正式命名为丁型肝炎病毒[4]。关于HDV的起源至今没有准确的说法，目前被提出的理论有2个：HDV可能源于植物类病毒；HDV是由宿主细胞的前信使RNA（pre-mRNA）剪切拼接而成的[5]。HDV是一种独特的人类病毒，形状为球形，直径为35～37nm，由HBsAg外壳和HDV核心颗粒组成[6]，核心颗粒包含1672～1697个碱基的环状RNA基因组，每个RNA分子上有70～200个拷贝数的HDV抗原基因，因此HDV是目前已知的人类最小的感染源。HDV通过HBsAg外壳感染肝细胞，通过滚动环状机制在肝细胞的细胞核内借助RNA聚合酶转录复制，在细胞质内组装上HBsAg外壳，然后从细胞中释放出来[7-9]。所以说HDV是一种缺陷病毒，其感染、包装和释放都必须依赖于HBV。

2 HDV的流行病学特点

HDV是一种全世界范围内的人类病原体，其传染源是急性或慢性丁型肝炎患者和HDV携带者。由于HDV的复制传播依赖于HBV，HBsAg携带者是HDV的保毒宿主和主要传染源，所以HDV在某地区的分布与当地乙型肝炎患者和HBsAg携带者分布情况有关。HDV是不经过肠道途径传播的。其传播途径包括：①血液传播：输血或血制品以及使用污染的注射器或针刺等，此外皮肤的开放性伤口的污染和吸血昆虫叮咬也会传播；②母婴垂直传播；③性接触传播：同性恋、异性恋、家庭配偶之间等[10]。

目前根据基因序列的不同将HDV分为8个基因型。Ⅰ型在全世界范围分布，具有病程多样化的特点，我国HDVⅠA亚型以河南株为代表，ⅠB亚型以四川、广西株为代表。其他所有基因型主要发生在特定的地理区域：Ⅱ型主要在日本、台湾和俄罗斯等亚洲地区盛行，病程相对较轻；Ⅲ型分布在亚马逊地区，通常引起暴发性肝炎[11]；Ⅳ型分布在日本和我国台湾等地；Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ型分布在非洲。多重基因型感染可在高危病人中反复发生，但通常以某个基因型为主要感染病毒株。另外，在台湾患者中还发现了Ⅰ和Ⅳ型丁型肝炎病毒RNA嵌合型病毒株感染[12-13]。

3 HDV的感染模式

HDV有3种感染模式，即HDV与HBV的重叠感染（super-infection）、HBV/HDV共感染（co-infec⁃tion）及HBV非依赖的HDV感染。重叠感染是指在慢性HBV感染的基础上合并有HDV感染，这种方式会使大部分患者（80％）发展为慢性HDV感染。一旦感染HDV，通常会加剧现有的肝病，所以若乙肝患者病情反复或症状加重时，要考虑是否有HDV与HBV重叠感染的可能，并建议患者进行HDV感染标记物的检测。共感染是指HBV和HDV同时感染。共感染与其他感染方式相比更严重，多表现为急性HDV感染，患者的血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）含量皆增高。关于HBV非依赖HDV感染的最初报道发生在肝移植术后，是患者在未感染HBV时已感染了HDV，此时HDV可存在于肝细胞内，可经免疫组织化学方法检测到。但只有在感染HBV后，HDV才可形成完整病毒颗粒并入血形成HDV病毒血症[14-18]。

4 HDV的实验研究模型

自HDV发现以来，为更好地进行病毒感染和复制等方面的研究，建立了多种HDV体内外感染复制模型。

4.1 体外模型

与HBV不同的是，HDV复制并不局限在肝细胞中，其也可以在多种哺乳动物细胞内高水平复制。肝癌细胞系的体外模型（例如Huh7）已被广泛应用于病毒复制的研究。由于HDV组装依赖于存在的HBV包膜蛋白病毒颗粒，所以HDV只能在伴随HBV转录的细胞内获得，或者是通过编码HBV包膜蛋白的共转染质粒获得[10]。原代人类肝细胞系、黑猩猩和树鼩原代肝细胞都易于感染HDV和HBV，但这些细胞不易获得，实验可重复性差。最近我国科学家发现的钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）是HDV和HBV的重要受体，将NTCP导入普通人类肝癌细胞系（如HepG2和Huh7）可实现HDV的感染复制，改善了实验的可重复性[19-21]。但迄今尚无HDV的稳定复制包装细胞系用于HDV的大规模稳定生产和抗病毒药物评价。

4.2 体内模型

虽然HDV自然感染似乎只出现在人类中，但是有些易感哺乳动物已被用于研究。黑猩猩、土拨鼠、树鼩、猴子等都曾被用于研究HDV，但都不理想。鸭子的肝细胞对于研究禽肝病毒属是很好的模型，但是不能维持HDV的复制[22-23]。

已建立了许多HDV感染和复制小鼠模型。直接注射HDV的野生型小鼠模型，结果表明这种小鼠不能被有效感染HDV[24]；后来改用HBV转基因小鼠模型，基于水动力质粒转染方法导致HDV在小鼠肝细胞内复制[25]；此外还有表达hNTCP的转基因小鼠模型，这种模型可以实现急性丁型肝炎感染，但是无法用于与HBV共感染或重叠感染的研究[26]。另外人鼠嵌合肝小鼠模型用于HBV和HDV感染比较完美，但模型构建比较昂贵，且对饲养条件要求高[10]。

建立简单有效的细胞模型和动物模型，是研究HDV生物学特点、细胞间相互作用及筛选抗HDV药物的主要工具。长期以来，由于简单特异的HDV体外感染模型非常匮乏，对HDV的复制周期、机理及有效的抗HDV药物的研究进展缓慢，迄今仍缺乏慢性丁型肝炎的有效治疗手段。

5 HDV的检测

5.1 HDV抗体（HDV-Ab）

HDV可诱发感染宿主的固有免疫应答和适应性免疫应答，刺激机体产生免疫球蛋白IgM和IgG。因此，血清中的HDV-Ab为HDV的特异性标记物之一，可通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫检定法（RIA）进行检测。

但是，这种检测存在着两方面的局限性：一方面，在感染后的第一天有可能检测不到HDVAb的存在，以至于HBsAg阳性的急性肝炎患者需要重新检测一次HDV-Ab。急性HDV感染时，HDV-Ab存在时间很短很难检出[10]，所以HDV-Ag阴性不能否定丁型肝炎的发生；而慢性HDV感染时，血液中的HDV-Ab和HDV-Ag形成免疫复合物，所以应分离之后再检测。另一方面，IgG与肝细胞受损和炎症活动密切相关，IgG会在HDV感染后持续存在，但是理想情况下，联合血清HDV RNA的检测结果才能确定HDV-Ab的阳性结果。IgM被认为是HDV感染中具有代表性的标志物之一，而且其清除效率与疾病的疗效紧密相关。IgM在HDV感染后3～9周能检测出，恢复期时可消失[27]。持续阳性提示慢性活动性肝炎，预后不佳[28]。

5.2 HDV抗原（HDV-Ag）

血清HDV-Ag检测的实用性是有限的。可通过ELISA和RIA进行检测。肝脏活检时，HDV-Ag可通过免疫荧光和免疫组织化学法等方法检测到[27]。在HDV急性感染抗体升高之前，有免疫力的患者血清中的HDV-Ag仅暂时出现。在HDV慢性感染时，免疫力低下的患者血清HDV-Ag也只是偶尔被检测到。但是在急性感染时，HDVAg与HDV RNA平行被检测，是判断HDV在体内感染的标志。

5.3 HDV RNA

核酸定量检测在HDV感染的诊断和治疗中都起着非常重要的作用。RT-qPCR检测具有快速、方便、特异等优点。但是，与HBV和HCV不同，由于HDV RNA中GC含量和互补性高，给HDV扩增带来了巨大的技术挑战，而且HDV的高度遗传变异性也使得需要精心设计其引物和探针[10]。所以，建立一个完善的PCR标准对于可靠地定量HDV RNA是非常必要的。2013年世界卫生组织（WHO）建立了一个以核酸扩增技术为基础检测HDV RNA的国际标准[29]。但必须注意的是，可能由于不同的患者病情不同，病毒基因型不同和定量的错误，病毒含量和疾病严重程度之间的相关性并不十分清楚。2014年Romeo等把HDV 59URT区域克隆到质粒，取得569bp的HDV片段，用于PT-qPCR方法检测患有丁型肝炎的肝硬化和肝癌患者的血清HDV RNA含量[30]；Botelho-Souza等将HDV cDNA克隆到一个线性质粒中作为标准来校正RT-qPCR的方法对HDV进行检测[31]；2016年Le Gal等将全球17个不同国家28个实验室对HDV的检测结果进行对比，表明不同实验室对HDV的定量结果差异较大，并发现定量方法中起重要作用的是引物和探针的设计[32]。

6 HDV的预防

在1980年代末，全球1500万人中至少有5％的HBsAg携带者也感染了HDV。从1990年代开始，随着HBV疫苗的接种，防治艾滋病的公共健康措施和社会卫生条件的提高，实现了HBV感染的有效控制和HDV感染率的连续大幅度衰减。HBV-HDV共同感染的减少引出丁型肝炎有望根除的理念并且意识到这种疾病正在减少。在台湾，HDV的重复感染率从1983年的23.7％减少到1996年的4.2％，至2002年，在吸毒者中抗HDV的检出率是39.0％（1986～1997年以每年4.7％的速度递减）[6]。所以，提高HBV疫苗的接种率，是预防丁型肝炎最有效的措施。此外，加强血液和血液制品的管理、防止医源性感染，以及提高卫生宣传教育的力度，增加民众的自我保护意识等措施也是非常必要的[33]。

7 HDV的治疗

目前还没有直接抗HDV的明确有效的临床治疗药物，这主要是由于HDV不编码有活性的酶，与其他病毒相比该病毒的复制完全依赖于宿主细胞。

对于急性丁型肝炎，目前没有特殊的有效治疗方案。病人管理依赖于监测和一般支持治疗。若患者的病情向暴发性肝炎发展，则需要考虑肝脏移植。

对于慢性丁型肝炎，目前干扰素α（IFNα）仍是惟一推荐的药物。在一部分患者中传统的干扰素和聚乙二醇干扰素（Peg-IFNα）均已被证明可以抑制HDV病毒血症。传统的IFNα的持续病毒学应答率（SVR）为14％～50％，Peg-IFNα的SVR为17％～44％。然而，由于治疗方案、用药剂量、用药时间等皆有高度的可变性，而且患者的数量也非常有限，对比研究是很困难的。另外还有几个关于IFN尚待解决的问题：第一，IFNα在HDV感染上的控制机制尚不明确，体外研究也没能证明IFNα在HDV复制方面的有效作用；第二，已经证明IL-28b基因多态性在丁型肝炎治疗中没有作用；第三，治疗的最佳时间不能确定。目前建议丁型肝炎患者最少治疗1年。虽然关于干扰素耐受的报道并不多见，但是长期的干扰素治疗仍存在争议[34-36]。

除去上述基础治疗，利用RNA分子干扰和多肽阻止病毒进入细胞的方法也正在探索当中，另外法尼基转移酶抑制剂也是潜在的有效药物，值得进一步研究[37]。

抗HBV的直接抗病毒药物（direct-acting anti⁃virals，DAA）（拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦等）在慢性丁型肝炎治疗中效果不佳[38-40]。对于疗效不明显的解释为HDV进入肝细胞只需要HBsAg外壳[41]，抗病毒药物虽然可以暂时抑制病情进展，但只要细胞核中HBV的共价闭合环状DNA（cccDNA）表达蛋白质，不管HBV是否存在或HBV DNA滴度的多少，HDV都可以很好地复制传播。因此，导致丁肝的治疗仍然面临巨大挑战。不过从理论上分析，核苷（酸）类似物虽然不影响HDV复制，但长期治疗可降低肝细胞中cccDNA的含量，从而降低HBsAg的产生[13]，所以核苷（酸）类似物在临床上的疗效还须长期和大样本研究来证实。

RNA干扰技术可以抑制病毒复制，这种技术作为抗病毒疗法已经应用于多种已知的病毒疾病。近年来关于小干扰RNA（siRNA）在抑制HDV复制的研究中有所报道但效果并不好，距离临床应用还有一定距离，但可以作为未来探索的一个方向[42-43]，尤其是通过抑制HBsAg的表达来抑制HDV的包装分泌方向值得进一步研究。

此外，一般支持治疗、中医中药及免疫调节剂的合理应用也有助于丁型肝炎的治疗[44-45]。

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Progress on Hepatitis D Virus Research

LI Ying1,ZHANG Wu-Xing1*,ZHOU Wei1,WANG Xue-Jun2*
1.The 309th Hospital of PLA,Beijing 100091;2.Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850;China
*Co-corresponding authors,ZHANG Wu-Xing,E-mail:zhangwuxing@sina.com;WANG Xue-Jun,E-mail:xjwang@bmi.ac.cn

Hepatitis D virus（HDV）,the satellite of hepatitis B virus（HBV）,is a worldwide human pathogen.The infection and replication of HDV are inseparable with HBV.China is one of the countries with high inci⁃dence of HBV infection,and many research projects focus on HBV but few on its satellite virus HDV.In this re⁃view,the latest developments in HDV molecular biology,epidemiological characteristics,experimental models,detec⁃tion,prevention and treatment were introduced and summarized comprehensively.We hope this paper can play a certain role in the future study of HDV.

hepatitis D virus;chronic D hepatitis;hepatitis B virus;research progress

R373.21

A

1009-0002（2017）04-0558-06

2017-01-04

国家高技术研究发展计划青年科学家项目（2015AA020946）

李颖（1989- ），女，硕士研究生，（E-mail）1027351956@qq.com

张五星，（E-mail）zhangwuxing@sina.com；王学军，（E-mail）xjwang@bmi.ac.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.031