乳品中细菌含量的自动识别与检测方法研究

陈思

（贵阳职业技术学院，贵州贵阳550023）

乳品中细菌含量的自动识别与检测方法研究

陈思

（贵阳职业技术学院，贵州贵阳550023）

乳品发生细菌污染可产生严重后果，威胁消费者健康。为提高乳品中细菌的检测精度，减少检测误差，我们开发一种自动识别检测方法。该方法采用图像采集识别技术与快速基因检测技术相结合的方法，实现自动识别乳品细菌总数、活菌数和细菌种类的目的，与经典的检测方法相比符合率达到99%以上，具有实时、快速、便捷、经济的优点，适合推广使用。

乳品；细菌污染；活菌数；细菌种类

乳品一直在人类食品中占有重要地位，其安全性对当今我国的食品安全问题具有显著影响，一直是政府和媒体关注的重点[1]。在众多危害乳制品质量的因素中，由于细菌污染导致的乳制品品质下降甚至产生毒性是主要的危害因素。受到细菌污染的乳品不仅仅对消费者健康产生危害，同时影响我国的乳制品行业和整个食品行业的声誉，甚至对我国的国家形象也会产生不良影响[2]。因此，采用科学的手段对乳品中污染细菌含量进行检测，具有较大的市场需求。传统的微生物含量检测方式是主要包括：光学显微镜计数法、电子仪器计数法、吸光度换算法、平板计数法、滤膜计数法、荧光或同位素染色法、流式细胞仪检测法等，这些经典的方法均存在一些缺点，比如：计数染料存在污染性，难以清除；滤膜法可以筛选出多种菌落，但无法精确计数；光学显微镜和电子仪器计数无法区分细胞的存活状态；平板计数法所需的检测时间过长，影响乳品的生产[3-5]。为了解决现存问题，我们开发了一套乳品中微生物含量自动检测识别的技术，该技术具有实时、准确和快速的特点，可以准确对乳品中的微生物含量进行定量，同时可以对微生物的种类进行识别。

1自动检测系统的组成

1.1乳品中细菌含量的自动识别检测技术的总体构成

完整的自动识别检测系统由4个主要部分组成，分别为样品前处理系统、图像采集与识别系统、快速基因检测系统和数据统计软件。样品前处理系统可以根据乳品浓度，按比例将PMT和乳品样本进行充分混匀，并进行光照激活处理，做好检测前的准备工作。处理好得样品需要通过自动进样器将10μL样品滴入检测台，准备开始图像采集和识别工作。图像采集与识别系统和快速基因检测系统是核心部分，通过显微镜对乳品样本中的菌体进行自动观察和拍照，连续记录3个视野后识别出菌落和菌团后进行分别计数和统计，得到10μL乳品中的细菌种类和数量。为了进一步得到乳品中活菌的数量，我们在第三部分设置快速基因检测系统，通过PMT-qPCR的方法对乳品样本中的活菌数目进行精确检测。至此，我们完成完整的检测工作，最后将得到的数据通过统计学软件进行分析，得到最终结果。完整的自动识别检测系统流程图如1所示，各部分系统详细功能描述如下：

图1 乳品中细菌自动识别检测方法的构成Fig.1 Thestructureof thebacteria autom atic identification detectionmethod in dairy products

1.2样本处理系统

无论是巴氏奶还是发酵乳，均存在脂肪浓度过高影响检测的现象，样品前处理系统的第一步通过高速离心（10 000 g，10min）的方法使乳品分层，去除干扰物质录。随后通过自动进样器，将20μgPMT注入1mL乳品样本中，经过低速混匀后，采用650W钨丝灯照射15min，达到样本的完全制备，准备进一步检测。

1.3显微镜自动检测识别系统

经过处理的样品首先经过显微镜自动检测识别系统检测，自动对3个视野下的所有物质进行图像分析。在图像采集阶段，软件内置判断模块，对拍摄图片的清洗度和分辨率进行比较，符合要求的图片进行下一环节，不符合要的图片需要重新拍照。通过软件对拍摄图片上的细菌进行识别和计算。该技术主要利用图像处理软件，在计算机上对照片事业上的细菌进行逐个识别，识别方法主要包括：预处理（图像对比增强）、对疑似细菌颗粒进行特征提取、采用最佳算法进行快速计算和对所有的细菌进行形态分类标号。具体的细菌识别方案如下：采用数学形态学中开运算的方法区分细菌间存在的粘附情况，采用十字结构4领域元素对细胞图像D（f，k）的原二值化进行膨胀和腐败处理，要求目标图像E（f，k）的初始数值为225，即为白色。分别对D（f，k）和E（f，k）的像素点进行逐个腐蚀计算，计算结束后，重新扫描每个像素点，再逐个进行膨胀运算，最后输出D（f，k）经过腐蚀覆盖后的图像，即为去除细菌间粘连的图像。经过该方案处理过的图像，细菌间的界面更平滑，菌团的纤细连接点分离，增大细菌间的间隙，而正常的未发生粘连的细菌不发生任何改变。在图像采集与识别系统中，微生物图像数据库是重要的组成部分，它根据当今报道的乳品微生物形态特征构建，利用网络资源可以做到实时更新，通知利用数学形态学的方法增大检索速度。目前对10个视野下的细菌进行拍照计数，得到数值后再根据细菌类型进行统计分析。

1.4快速基因检测系统

快速基因检测系统是以PMA-qPCR为基础的检测方法，其中PMA是一种可以在蓝光作用下与双链DNA结合的染料。PMA具有叠氮基团可以被蓝光激活产生氮烯自由基，该自由基具有高活性特点可立即与核酸形成稳定的共价键，将PMA稳固的粘附在DNA上，抑制扩增反应，导致该DNA无法进行qPCR检测。PMA具有一个显著的生物学特点，其不能通过活菌细胞膜而无法与其基因组结合，只能通过死亡细胞的细胞膜与死菌基因组结合，这一功能被广泛应用在活菌数量检测试验。在本试验中，我们利用PMA这一特性，在细菌基因组提取前先使用PMA溶液处理细菌，充分抑制死亡细菌基因组，保证qPCR的模板来自于活菌。在PMT处理后，采用商品化细菌基因组提取试剂盒进行基因组提取，提取步骤严格按照操作说明书进行，随后立即进行qPCR检测，检测使用的通用引物为16S-14f：CCGTACATAGCAGGGCCCAG；16S-15r：GAT CTAGTGATTCGACTAGCAGCCG。共扩增长度为289bp。该引物覆盖常见乳品污染细菌35种，具有广泛的通用性。PCR反应体系如下，反应条件：95℃8min，38个循环（95℃30 s，55℃45 s，72℃30 s）。每个样本设置3个平行检测孔，试验接受后取3孔的平均Ct值，并经过我们反复测定，证实该方法检测Ct值在26.60～29.25间，乳品中每1mL含菌量小于1.25×105CFU/mL。

1.5数据统计系统

我们以SPSS18.0为基础开发一套数据自动转换软件，该软件可以根据Ct值直接进行活菌数换算，简单快捷，准确性高。

1.6实际样本检测分析

2015年8月～12月，我们从吉林省某乳业采集收细菌污染的乳品样品共20份。在进行试验前均进行人工显微镜计数、平板计数、细菌形态学和微生物自动分析仪鉴定，完成后采用我们的自动识别检测方法对样品进行检测。

1.7数据统计与分析

所有数据的统计分析均采用spss18.0，计量资料进行采用t检验，计数资料采用Χ2检验，P＜0.05为差异显著，具有统计学意义。

2结果与分析

2.1实际样品细菌总数检测

我们采用经典的平板计数法计算乳品样品中的细菌数量作为对比，但需要注意的是平板计数法仅可以检测活菌数，细菌总数检测见表1。

表1 细菌总数检测Table1 The totalnumber of bacteria detection

如表1所示，我们建立的方法检测的细菌总数与经典镜检计数符合率达到95%以上，活菌总数与平板计数结果符合率达到100%，具有准确性优势，同时所需而时间仅为平板计数的1/5，因此具有时效性优势。

2.2实际样品细菌种类检测

我们采用人工显微镜形态学观察和微生物鉴定仪作为对照，比较我们建立的检测方法的准确性。样品细菌种类检测结果如表2所示。

表2 样品细菌种类检测Table2 Bacterialspecies test sam ple

续表2样品细菌种类检测Continue table2 Bacterialspecies test sample

由表2可知，我们建立的检测方法对乳品中细菌种类识别的数量明显高于人工显微镜观察（P＜0.05），与微生物鉴定仪的符合度达到99%以上。

3讨论

乳制品具有易消化和营养丰富的优点，其中富含蛋白质、糖类、脂肪、维生素、无机盐等营养物质，是一种制备简单经济实惠的优质食品，受到广大消费者喜欢[6]。由于营养丰富，乳品也容易受到细菌污染，细菌繁殖过程中大量消耗乳品营养，同时产生有毒的代谢产物，影响乳品的风味和营养价值，同时消费者食用后可能产生严重中毒现象[7-8]。因此实时监测乳品的细菌污染现象，对提高我国乳品形象，维护乳品行业的信誉，保护消费者健康具有积极影响。在本研究中我们提出一种乳品污染细菌的自动识别检测方法，通过分析捕捉到的图像资料，依据建立的细菌形态学数据库，采用数学形态学的方法可以快速进行细菌计数和种类鉴定。同时为了进一步判断乳品污染的活菌数，我们提出一种PMT-qPCR的检测方法，可以在3 h内对乳品中的活菌数进行精确计数。与传统的方法相比，我们的方法具有实时、准确、快速的优势，大幅度缩短试验时间，同时所需的仪器要求不高，大部分试验室均有可以立即使用。在将来的研究中，我们将以此方法为基础，开发一套具备自动进样、自动检测和自动读值的检测设备，为维护我国乳品品质，维持食品安全，尽一份力。

参考文献：

[1]田波,霍贵成,籍婷,等.乳与乳制品中细菌总数的检测技术[J].中国乳品工业,2004,32(2):27-31

[2]孙芝杨,黄闯,杨福臣,等.伏安法快速检测乳制品中细菌的总数[J].中国乳品工业,2016,44(7):47-49

[3]贾宗艳,任发政,郑丽敏,等.电子鼻技术及在乳制品中的应用研究进展[J].中国乳品工业,2006,34(4):35-38

[4]杨军,张驰,刘新梅,等.多重PCR法对乳制品中3种致病菌的同时快速检测[J].中国乳品工业,2010,38(4):50-53

[5]唐玲,王晓静,周国君,等.运用PCR-DGGE技术分析原料乳中腐败细菌的多样性[J].贵州农业科学,2013,41(5):151-154

[6]唐丽新,肖凤娟,王力群,等.浅析乳和乳制品的营养价值[J].畜牧兽医科技信息,2012(11):8-9

[7]谢雪涛,王忠德.牛奶及饮料中细菌污染的检测[J].同济大学学报(医学版),2002,23(3):234-235,240

[8]张修军,姚晶.离心除菌与巴氏杀菌在原料奶预处理中应用的研究[J].中国乳业,2014(10):42-44

Research on Bacteria Autom atic Identification and Detection M ethod in Dairy Products

CHENSi
（Guiyang Vocationaland TechnicalCollege，Guiyang 550023，Guizhou，China）

Dairy bacteria pollution could caused seriousconsequences，threatened the consumershealth.To improve the accuracy ofbacteria detection in dairy products，and reduced detection error，an automatic identification detectionmethodwere developed.Themethod uses image acquisition and recognition technology combinedwith rapid gene detection technology to realize the purposeofautomatically identifying the totalnumberof bacteria，number ofviable bacteria and bacteria species.Compared with the classical detectionmethod，the co incidencerateismorethan99%，andhad fast，convenient，economicadvantages，suitable forpromotionanduse.

dairyproduct；bacterialcontamination；viablecount；bacterialspecies

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.040

2016-10-20

陈思（1983—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：生物技术。