固相萃取超高效液相色谱法测定食品中非法添加色素红2G

王韦达，肖泽恩，李芸，崔晶，杜业刚

（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518100）

固相萃取超高效液相色谱法测定食品中非法添加色素红2G

王韦达，肖泽恩，李芸，崔晶，杜业刚*

（深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518100）

建立快速测定食品中的非法添加色素红2G的固相萃取超高效液相色谱分析方法。选取可能添加红2G的香肠、红酒、红醋、糖果、年糕、牛肉干、海鲜酱、辣椒酱、胡椒粉、辣椒粉、辣椒油、火锅底料作为分析对象，样品用50%（体积分数）甲醇水溶液提取，经固相萃取小柱净化，以含乙酸（0.02moL/L）的乙酸铵（0.01moL/L）水溶液和甲醇为流动相，经C18色谱柱分离，二极管阵列检测器检测，检测波长508 nm。红2G在0.2mg/L～100mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数为1.000 0，方法检出限为0.03mg/kg，样品平均回收率在80%以上，相对标准偏差小于5%（n=6）。该方法灵敏度高，精密度好，分析时间短，适用于食品中非法添加色素红2G的检测。

红2G；固相萃取；超高效液相色谱

食品色泽是食品外观质量的重要指标，令人赏心悦目的颜色可以提高消费者的购买欲望。食用色素作为食品添加剂在各类食品中的广泛应用，改善了食品外观，丰富了食品种类。近年来，一些不法商家为降低成本向食品中违法添加价格低廉的工业色素来代替食用色素，导致与工业色素相关的食品安全事件频发。工业色素大多是偶氮类染料，具有一定的毒性，添加在食品中会给消费者健康带来安全隐患。

红2G是一种工业合成色素，属于偶氮类染料，又名酸性红1和食品红10。由于其价格低廉，着色力强，曾在欧洲地区用于香肠、海鲜酱、辣酱等食品的着色。2007年欧洲食品安全局发现红2G在人体内会代谢成致癌物质苯胺，具有诱发癌症的可能性，随即公布红2G在欧盟27国内禁止在食品中使用[1]，中国、美国、加拿大、日本等国家也已经明确禁止食品中使用红2G[2]，然而在我国市场上仍能发现某些食品中存在违法添加红2G的迹象，因此有必要建立准确、有效的红2G检测方法。目前我国还未制定食品中红2G检测的标准分析方法，文献中报道的分析方法主要有高效液相色谱法[3-4]和液相色谱-串联质谱法[5-7]，但是这些方法只适用于检测单一食品或者少数几类食品，不能对市场上各类食品进行全面有效的监督。

本试验选取可能添加红2G的香肠、红酒、红醋、糖果、年糕、牛肉干、海鲜酱、辣椒酱、胡椒粉、辣椒粉、辣椒油、火锅底料作为分析对象，采用甲醇水溶液对样品进行提取，WAX固相萃取小柱净化，建立了适用于各类食品中红2G检测的超高效液相色谱分析方法，该方法适用范围广、灵敏度高、快速准确，可为食品安全监管提供有效的技术手段。

1试验部分

1.1仪器与试剂

超高效液相色谱仪（UPLC，配二极管阵列检测器）、OasisHLB固相萃取小柱（60mg，3mL）、C18固相萃取小柱（500mg，3mL）、OasisMAX固相萃取小柱（60mg，3mL）、OasisWAX固相萃取小柱（60mg，3mL）：美国Waters公司；固相萃取装置：美国Agilent公司；IKA KS4000icontrol摇床、IKAGENIUS 3涡轮器：德国IKA公司；HERMLE Z323高速离心机：德国Hermle－Labortechnik公司；Turbovap LV氮吹仪：美国Caliper公司；微孔过滤膜（0.22μm）：美国Millipore公司。

甲醇（色谱纯）：Merck公司；冰乙酸（色谱纯）：上海安谱；冰乙酸（分析纯）、氨水（分析纯）：上海凌峰；红2G标准品：购自Sigma-Aldrich；试验用水均为超纯水。

含冰乙酸（0.02moL/L）的乙酸铵（0.01moL/L）水溶液：称取乙酸铵0.771 g于1 L容量瓶中，量取1.2mL冰乙酸加入此容量瓶中，加水定容。

标准储备溶液：称取红2G标准品0.020 0 g于100mL棕色容量瓶中，用超纯水定容，制备成200mg/L标准储备溶液。

标准工作溶液：将上述标准储备液用水稀释为0.200、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 mg/L的标准溶液，在给定的仪器条件下进行液相色谱分析。

1.2样品前处理

1.2.1提取

称取约2 g样品，精确至0.001 g，置于50mL离心管中，加入甲醇和水各5.0mL，摇床震荡提取30min，于7 800 r/min离心5min，上清液待净化。

1.2.2净化

WAX小柱依次用3.0mL甲醇和3.0mL水活化，将上清液转移至活化的WAX小柱中，再依次用2.0mL水和2.0mL甲醇淋洗，最后用5.0mL氨水甲醇（10∶90，体积比）洗脱，洗脱液于50℃氮吹至干，加入1.0 mL水定容，涡旋震荡溶解，过0.22μm微孔滤膜，供液相色谱测定。

1.3色谱分析条件

色谱柱：ACQUITYUPLCBEH C18（100×3.0mm，1.7μm）；流动相：甲醇/含冰乙酸（0.02moL/L）的乙酸铵（0.01moL/L）水溶液=35/65；流速：0.3mL/min；柱温：25℃；进样量5.0μL；检测波长：508 nm。

2结果与讨论

2.1样品前处理条件优化

2.1.1提取溶剂的选择

选取基质复杂的辣椒油加标进行分析，加标质量浓度为10mg/kg，分别以水、甲醇、乙腈、甲醇-水（1∶1，体积比）和乙腈-水（1∶1，体积比）作为提取溶剂，经过WAX小柱净化后分析测定，试验结果见表1。

表1 不同提取溶剂的回收率结果（n=3）Table1 Recovery of red 2G with differentextraction solvents（n=3）

结果表明，在所有提取剂中甲醇-水（1∶1，体积比）对红2G的提取效率最好。采用甲醇-水（1∶1，体积比）作为提取剂对其他11种食品进行试验，都可以得到满意的回收率。

2.1.2固相萃取柱的选择

选取基质复杂的辣椒油进行加标试验，对固相萃取小柱HLB、C18、MAX和WAX进行了考察研究，结果显示WAX小柱对红2G有高选择性的保留作用，经过洗脱后可以得到较高的回收率。采用WAX小柱对其他11种食品进行加标试验，同样可以得到较好的回收率。

2.2色谱条件的优化

试验考察了甲醇、乙腈和含冰乙酸的乙酸铵水溶液组配的流动相体系，发现当以甲醇/含冰乙酸（0.02moL/L）的乙酸铵（0.01 moL/L）水溶液=35/65作为流动相等度洗脱时，红2G的峰型较好，标准溶液色谱图如图1所示。

2.3不同样品基质对红2G测定的影响

样品中大部分杂质在净化过程中被除去，未被除去的杂质在分析时也可与红2G得到较好的分离，图2所示是辣椒油样品的液相色谱图，其中A和B分别为空白样品和加标样品。

图1 红2G标准溶液超高效液相色谱图（浓度为1.00mg/L）Fig.1 Liquid chromatogram of red 2G（1.00mg/L）

图2 辣椒油空白样品和加标样品的超高效液相色谱图Fig.2 Liquid chrom atogram sof blank and spiked capsicolsamples

试验结果表明：样品经过该前处理方法净化后，不存在杂质干扰的情况，可以保证分析方法的灵敏度和准确度。

2.4线性范围和检出限

在选定的色谱条件下，将浓度为0.200、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100mg/L红2G标准工作液进行测定，红2G标准系列浓度与峰面积线性相关，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性方程为y= 41 999.3x-7 069.2（相关系数为1.000 0），方法检出限为0.03mg/kg（S/N=3），定量限为0.1mg/kg（S/N=10）。

2.5回收率和精密度

以不含红2G的香肠、红酒、红醋、糖果、年糕、牛肉干、海鲜酱、辣椒酱、胡椒粉、辣椒粉、辣椒油、火锅底料为分析对象，分别添加1、10、40mg/kg3个质量浓度水平，每个添加水平平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。试验结果如表2所示，样品平均回收率在80%以上，相对标准偏差小于5%（n=6）

表2 食品中红2G的添加回收试验结果（n=6）Table2 Recovery of red 2G from spiked samples in food（n=6）

续表2食品中红2G的添加回收试验结果（n=6）Continue table2 Recovery of red 2G from spiked samples in food（n=6）

3实际样品检测

从本地超市和批发市场随机购买了香肠、红酒、红醋、糖果、年糕、牛肉干、海鲜酱、辣椒酱、胡椒粉、辣椒粉、辣椒油、火锅底料各10份样，应用所建立的分析方法对这些样品进行了红2G测定，结果均未检出。虽然检测结果显示，在随机选取的12种食品中均未检测到红2G，但由于检测样本量少，并不代表不存在红2G违法添加的潜在风险，因此有必要持续对市售的食品进行监测，以保证食品质量安全。

4结论

本试验用甲醇-水提取红2G，通过WAX固相萃取柱进行净化前处理，采用超高效液相色谱仪进行检测，建立了用于食品中检测红2G的液相分析方法，该方法灵敏度高，抗干扰能力强，快速准确，适用于食品中红2G的日常分析和监测。

[1]周梅.欧盟将禁止使用食品色素“红色2G”[J].世界农业,2007 (11):70

[2]屠海云,肖海龙,朱顺达,等.液相色谱-串联质谱法测定食品中红2G、酸性红、酸性红52着色剂方法研究[J].中国食品,2011 (10):82-84

[3]刘瀚升.高效液相色谱法同时测定熟肉制品中的罗丹明B、苏丹红I、II、III、IV、碱性橙2、21、22、酸性橙II和红2G[J].实用预防医学,2016,23(1):108-110

[4]宋月,白欣,康译友,等.熟肉制品中红2G的超高效液相色谱检测法[J].微量元素与健康研究,2015,32(4):32-33

[5]周日东,林胜军,丘福保,等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定火腿肠中的红2G工业染料[J].中国卫生检验杂志,2015, 25(15):2497-2499

[6]冯峰,杨烁,凌云,等.超高效液相色谱-串联质谱快速筛查葡萄酒中的14种禁用食品添加剂[J].分析化学,2011,39(11):1732-1737

[7]伊雄海,邓晓军,杨惠琴,等.液相色谱-串联质谱法检测食品中的多种易滥用着色剂[J].色谱,2011,29(11):1062-1069

Determ ination of Red 2G in Food by Solid Phase Extraction-Ultra High Performance Liquid Chromatography

WANGWei-da，XIAOZe-en，LIYun，CUIJing，DUYe-gang*
（Shenzhen Academy ofMetrology and Quality Inspection，Shenzhen 518100，Guangdong，China）

A method based on solid phase extraction-ultra high performance liquid chromatography for rapid determination of red 2G in foodwasestablished.Taking sausage，redwine，red vinegar，candy，rice cake，beef jerky，hoisin sauce，chillisauce，pepper，paprika，capsicol and hotpot condiment in which red 2G probably wasadded as research objects，red 2G in sampleswas extracted by 50%（volume fraction）methanol aqueous solution and then purified with a solid phase extraction column.Red 2G was separated by a C18 column（100 mm×3.0 mm，1.7μm）with methanol and ammonium acetate（0.01 moL/L）containing acetic acid（0.02 moL/L）as mobile phase.The detection wavelength was 508 nm and a good linear relationship was achieved over the rangeof0.2mg/L to100mg/Lwith a correlation coefficientof1.000 0.The detection limitwas 0.03mg/kg and the average recovery for spiked sampleswasover 80%with the relative standard deviation less than 5%（n=6）.Themethod possessed high sensitivity，good precision and shorteranalysis time，suitable for fastdetermination of red 2G in food.

red 2G；solid phaseextraction；ultraperformance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.036

2016-06-16

深圳市计量质量检测研究院科技项目（2016-YA19）

王韦达（1984—），男（汉），工程师，硕士，研究方向：食品化学分析。