响应面法优化灵芝红茶的制作工艺

刘良琴，龚小见，*，周欣，赵超，陈华国

（1.贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州贵阳550001；2.贵州师范大学贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州贵阳550001；3.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵州贵阳550001）

响应面法优化灵芝红茶的制作工艺

刘良琴1，2，3，龚小见1，2，3，*，周欣1，2，3，赵超1，2，3，陈华国1，2，3

（1.贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州贵阳550001；2.贵州师范大学贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州贵阳550001；3.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵州贵阳550001）

为系统地探究灵芝红茶的制作工艺，采用灵芝提取物和遵义顶级红茶为主要原料，以感官评价为主要评价指标，以单因素试验研究灵芝提取物用量、烘烤温度、烘烤时间对灵芝红茶得分的影响，采用响应面分析法和Box-Behnken试验优化灵芝红茶的最佳工艺参数，同时对灵芝红茶中主要活性成分茶多酚和多糖的含量进行测定。结果显示：灵芝提取物用量为0.93 g，烘烤温度为79℃，烘烤时间为61min，以此工艺制备的灵芝红茶在响应面法中感官评价得分预测最大值为87.2，实测值为86.1。灵芝红茶产品中茶多酚含量为136.0mg/g，多糖含量为36.39mg/g，水分含量为5.38%。灵芝红茶产品外形优美，色泽乌润均匀，口感醇厚，具有灵芝甜香与红茶的混合香味。

灵芝红茶；工艺；Box-Behnken响应面优化；茶多酚；多糖

灵芝[Ganoderma lucidum（Fr.）Karst]为担子菌门（Basidiomycota）担子菌纲（Basidiomyce-tes）多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（Ganoderma）的一种药用真菌[1]，又称“灵芝草”、“仙草”、“瑞草”，也叫长生草、灵草、还魂草，在我国有悠久的药用历史。我国古人认为灵芝是一种超自然的神药仙草，其实灵芝在自然界中广泛存在。《本草纲目》中记载，灵芝“甘温无毒，主治耳聋，利关节，保神，益精气，坚筋骨，好颜色，疗虚劳，治痔”。现代研究表明，灵芝具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、提高机体耐缺氧能力[2-3]等活性。因此，灵芝相关的产品越来越受到人们的青睐。

茶是我国的一种传统饮品，具有低糖、低脂、低热量和天然无污染的特点，有减肥、保护肠道、提神消疲、降血脂、防止血管硬化、利尿排毒、防辐射、抗衰老、抗肿瘤、抗菌[4-7]等功效。茶叶本身就是一种很好的天然保健饮料，一直深受世人的喜爱，具有深入开发的基础。

灵芝红茶是以赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.Fr.）Karst.]和红茶为原料生产的一种具有保健功能的饮品，同时具有灵芝和红茶的保健功效。但是目前市场上的灵芝红茶的生产工艺比较粗放，产品质量不稳定。因此本研究运用单因素及响应面设计的方法[8]，对灵芝红茶的生产工艺进行系统的探究和优化，以感官评价[9]作为考察指标最终确定灵芝红茶的最佳制作工艺，并对灵芝红茶中活性成分茶多酚和多糖的含量进行测定，以期为灵芝红茶工业化生产提供科学依据。

1材料

1.1试材

赤芝、红茶：贵州高山黔灵原生态健康品有限公司；水：娃哈哈桶装水；没食子酸、无水葡萄糖（纯度≥98%）：贵州迪大生物科技有限公司；福林酚：上海蓝季科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器

AL 204万分之一分析天平、XS 105十万分之一分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；101-2 AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TD5M低速多管架自动平衡离心机：长沙迈佳森仪器设备有限公司；SPECTRAmax PLUS 384光吸收酶标仪：美国分子仪器公司MolecularDevices。

2方法

2.1灵芝提取物的制备工艺流程

2.3茶叶复火

据以往实践经验，在灵芝红茶配制前，先将8 g茶坯在100℃温度烘烤1 h，将茶坯含水量控制在3%以下，这样茶条才能把灵芝提取物溶液充分吸附在茶条内外，尽可能保持原茶叶耐冲泡的特点。

2.4试验设计

以灵芝提取物、红茶为主要原料，通过单因素实验初步确定灵芝红茶生产工艺优化范围，然后采用Box-Behnken响应面优化法，以感官评价为考察指标确定灵芝红茶最佳的制作工艺。

2.5评定方法

2.5.1感官评价方法

取茶叶按照1∶60（质量比）的比例加水冲泡。选取感官评价员10名，根据感官评价表对灵芝红茶产品进行评分，感官评定指标及评定方法见表1。

表1 感官评价表Table1 Organoleptic evaluation

2.5.2理化成分的测定

茶多酚的含量测定：精密称取灵芝红茶样品0.2 g，加入50%的乙醇5.0mL，超声提取30min，离心取上清液。重复提取两次，合并提取液并定容到10mL。以Folin-Ciocalteu法[10]测定茶多酚含量，以没食子酸为标准，计算茶多酚含量。

总多糖的含量测定：精密称取灵芝红茶样品0.5 g，加入5.0mL水，在80℃下超声提取40min，离心取上清液。重复提取两次，合并提取液，加入无水乙醇使乙醇的体积分数达到80%，于4℃下醇沉24 h后，离心，倾去上清液。沉淀加水溶解转移到10mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。以苯酚-硫酸法[11]测定多糖含量，以葡萄糖为标准，计算总多糖含量。

2.6 数据处理与统计分析

文中数据处理采用Design-Expert8.0.6和Office 2013软件。

3结果与分析

3.1灵芝红茶制作工艺的单因素试验

3.1.1灵芝提取物用量考察

灵芝提取物用量明显影响灵芝红茶的风味，用量过多导致灵芝红茶后苦味过重，适口性较差。因此，以单因素试验对灵芝提取物用量进行考察，并对其进行感官评定。固定烘烤温度100℃、烘烤时间60min的条件下，考察灵芝提取物用量分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g。如表2所示，随着灵芝提取物用量的增加，得分逐渐提高；当灵芝提取物用量超过1.00 g时，得分开始降低。因此，最佳灵芝提取物用量为1.00 g。

表2 灵芝提取物用量的确定Table2 Determ ination of contentof Ganoderma lucidum extract

3.1.2烘烤温度的考察

烘烤温度的高低会影响茶叶的口感以及外形的匀整度，进而影响茶汁的澄清度和叶底的观感。因此，以单因素试验对烘烤温度进行考察，固定灵芝提取物用量1.00 g、烘烤时间60min的条件下，考察烘烤温度分别为50、60、70、80、90、100℃，结果如表3所示。

表3 烘烤温度的确定Table3 Determ ination of baking tem perature

由表3可知，随着烘烤温度的上升，得分逐渐提高；当烘烤温度超80℃时，得分趋于平缓。因此，最佳烘烤温度为80℃。

3.1.3烘烤时间考察

烘烤时间的长短直接决定灵芝红茶香味以及含水量的高低等。因此，以单因素实验对烘烤时间进行考察，固定灵芝提取物用量1.00 g、烘烤温度80℃的条件下，考察烘烤时间分别为30、40、50、60、70、80min，结果如表4所示。

由表4可知，随着烘烤时间的增加，得分逐渐提高；当烘烤时间超60min时，得分趋于平缓。因此，最佳烘烤时间为60min。

表4 烘烤时间的确定Table4 Determ ination of baking tim e

3.2响应面试验设计优化分析

3.2.1回归方程的建立及方差分析

根据单因素试验的考察结果，发现灵芝提取物用量、烘烤温度和烘烤时间都会对灵芝红茶品质产生重要影响，并且确定了大致的优化范围。因此以感官评价为因变量，选取灵芝提取物用量（A）、烘烤时间（B）和烘烤温度（C）3个因素为自变量，设计了三因素三水平二次回归方程来拟合因素和指标（响应值）之间的函数关系，采用Box-Behnken响应面优化的方法寻求最优的制作工艺。试验设计与结果分析如表5、表6、表7所示。

表5 响应面分析因子及水平表Table5 Factor and level in response surfaceanalysis

表6 响应面分析方案及试验结果Table6 Experimental resultsof response surfaceanalysis

续表6响应面分析方案及试验结果Continue table6 Experim ental resultsof response surfaceanalysis

表7 试验结果方差分析Table7 Statisticalanalysisof three factorswith three levels

试验结果釆用Design-Expert8.0.6软件的ANOVA程序，进行二次回归分析，得到灵芝红茶感官评价（R1）与影响因素自变量灵芝提取物用量（A）、烘烤时间（B）和烘烤温度（C）的二次多项回归方程为：R1=+ 86.87-1.48A+1.47B-1.39C-4.20AB+2.96AC+4.85BC-3.79A2-12.25B2-9.77C2。

由表7可得，模型P值0.000 1＜0.05（显著），失拟项P值0.056 5＞0.05（不显著），R2=0.992 7，调整决定系数R2Adj=0.983 3，表明模型在研究的整个回归区域内模型拟合较好且自变量与响应值线性关系显著。由回归模型系数显著性检验结果可得知：灵芝提取物用量、烘烤时间、烘烤温度的二次项及交互项的P值均小于0.01，说明对灵芝红茶感官评价得分的影响极显著。影响灵芝红茶感官评价的主次因素排列顺序为灵芝提取物用量＞烘烤时间＞烘烤温度。

3.2.2响应面分析及优化

通过design-expert8.0.6软件进行二次多元拟合得出响应面3D图及对应的等高线分析图，在固定其他因素水平值的情况下观察各因素间的交互作用对灵芝红茶得分的影响，所得响应面如图1、图2、图3所示。图1（B），2（B），3（B）中等高线都为椭圆形，说明3个因素间都有较强的交互作用。

图1 灵芝提取物用量及烘烤时间交互的响应面（A）及等高线（B）Fig.1 Responsesurfaceand contoursof interaction between the contentof Ganoderma lucidum extractand Baking tim e

3.2.3验证试验

图2 灵芝提取物用量及烘烤温度交互的响应面（A）及等高线（B）Fig.2 Response surfaceand contoursof interaction between the contentof Ganoderma lucidum extractand baking temperature

图3 烘烤时间及烘烤温度交互的响应面（A）及等高线（B）Fig.3 Response surfaceand contoursof interaction between baking timeand baking temperature

通过试验模型分析，得到预测最优工艺条件为灵芝提取物用量为0.93 g，烘烤温度为79.08℃，烘烤时间为60.90min。将最优工艺条件调整为灵芝提取物用量为0.93 g，烘烤温度为79℃，烘烤时间为61min。取红茶8 g，按照上述工艺条件，重复3次试验，灵芝红茶感官评价得分为86.1，灵芝红茶感官评价预测分数为87.2，实测值与模拟预测值的差值为1.26%，且变异系数为1.65%，由此验证了模型的合理性和可靠性。

4结论

利用实验设计软件Design-Expert8.0.6，以单因素结合Box-Behnken响应面设计优化的方法，以感官评价为主要评价标准，通过二次回归设计得到了灵芝红茶最佳的制作工艺条件为灵芝提取物用量为0.93 g，烘烤时间为61min，烘烤温度为79℃。以此工艺制备的灵芝红茶在响应面法中感官评价得分预测值为87.2，实测值为86.1。产品外形优美，色泽乌润均匀，灵芝提取物与红茶混合均匀，苦味适中，口感较好，具有灵芝甜香与红茶的混合香味。此工艺下制备的灵芝红茶中总多酚含量为136.0mg/g，总多糖含量为36.39mg/g，水分含量为5.38%；市售的灵芝红茶中总多酚含量为124.8mg/g，总多糖含量为25.37mg/g，水分含量为8.39%。优化后的灵芝红茶中多糖含量高于市售的灵芝红茶，说明经过优化后灵芝红茶的产品质量有所提升。灵芝红茶制作工艺的研究，对用灵芝红茶工业化生产提供了一定依据。

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Response Surface M ethodology App lied in the Optim ization of Ganoderma lucidum Black Tea M anufacture

LIU Liang-qin1，2，3，GONGXiao-jian1，2，3，*，ZHOUXin1，2，3，ZHAOChao1，2，3，CHENHua-guo1，2，3
（1.Key Laboratory for Information System ofMountainousAreasand Protection of EcologicalEnvironment，Guizhou NormalUniversity，Guiyang550001，Guizhou，China；2.Guizhou Engineering Laboratory forQuality Control&Evaluation TechnologyofMedicine，Guizhou NormalUniversity，Guiyang550001，Guizhou，China；3.TheResearch Center forQuality ControlofNaturalMedicine，Guizhou NormalUniversity，Guiyang550001，Guizhou，China）

To systematically optimize themanufacture of Ganoderma lucidum black tea，Ganoderma lucidum and top black teaof Zunyiwasused as the rawmaterial.By settingsensory evaluation as the criteria，the formula was preliminarily determined by using the single factor testand thenwas further optimized by Box-Behnken design and response surfacemethodology，and determinated the contentof themain active ingredient in Ganoderma lucidum black tea products.The optimized conditionsas follow：The contentof Ganoderma lucidum extract was 0.93 g，baking temperature 79℃，bake for 61min.The sensory score of Ganoderma lucidum black tea made by using this optimal formula was 86.1，approximating to the predicted value of 87.2.Content of tea polyphenol and polysaccharide in Ganoderma lucidum black tea was 136.0 mg/g，36.39 mg/g respectively，moisture contentof5.38%.This productshowed appearance exquisite，colour lustre，tastemellow，sweetness with Ganoderma lucidum mixedwith black teaaroma.

Ganoderma lucidum black tea；manufacture；Box-Behnken design and response surface；tea polyphenols；polysaccharides

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.022

2016-11-22

贵州省贵州师范大学研究生创新基金项目（研创2015021号）；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（黔科合中药字[2013]5001号）；贵州省高层次创新人才培养项目（黔科合人才（2015）4033号）

刘良琴（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：药用植物开发与利用。

*通信作者：龚小见，副教授，硕士生导师。