响应面法优化超声波辅助提取废弃烟叶中芦丁的研究

李海洋，李莹，李荣华，吕永华，夏岩石，李钟，郭培国，*

（1.广州大学生命科学学院，广东广州510006；2.广东省烟草专卖局，广东广州510610；3.广东药科大学中药学院，广东广州510006）

响应面法优化超声波辅助提取废弃烟叶中芦丁的研究

李海洋1，李莹1，李荣华1，吕永华2，夏岩石1，李钟3，郭培国1，*

（1.广州大学生命科学学院，广东广州510006；2.广东省烟草专卖局，广东广州510610；3.广东药科大学中药学院，广东广州510006）

以烟草废弃烟叶作材料，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取提取温度、超声时间、乙醇体积分数作为优化因素，在单因素试验的基础上，采用响应面法对废弃烟叶中芦丁的提取工艺进行优化。试验结果表明芦丁提取的最佳工艺参数为：提取温度57.5℃、超声时间20.3min和乙醇体积分数32.6%，提取率为13.7mg/g，与理论预测值的相对误差为1.0%，说明响应面法可以很好地优化废弃烟叶中芦丁的提取工艺。这一结果可为烟草废弃物的综合利用提供参考。

响应面法；废弃烟叶；芦丁；提取

芦丁（又称芸香苷）属于多羟基黄酮类化合物，是一种天然抗氧化剂[1]，具有抗菌、消炎、抗氧化等多种药理活性，在临床上主要用于治疗高血压、心血管疾病、胃病、皮肤病、痛风等多种疾病[2]，现已广泛用于医药、保健食品和化妆品等行业。芦丁广泛存在于植物中，提取方法主要有碱提取酸沉淀法、热水提冷析出法、大孔树脂分离法、超声辐射法、乙醇浸提法等[3-6]，但多存在提取效率低、成本高、工艺流程长、提取芦丁的纯度差等不足[7]。近年来的研究表明超声波辅助提取芦丁的效果较好，提取率高且需时较少[8-9]。芸香科的芸香草、豆科的槐米和蓼科的苦荞等是目前国内芦丁提取的主要原料[7，10-11]，但这些植物原料资源紧缺，难以满足市场的需求。

我国是世界上最大的烟草生产国和消费国[12]，在烟草收获和生产过程中存在大量的低次烟叶、烟筋、烟茎和烟花等烟草废弃物[13]，大多被作为垃圾随地焚烧处理，造成了严重的生态环境污染。然而，烟草废弃物却是具有很高潜在价值的资源，含有多种活性成分，可用于烟草的综合开发利用[14]。现阶段，对烟草废弃物中的烟碱、茄尼醇、蛋白质等活性成分综合利用的研究较多[15-16]，鲜见有对约占烟草干重1%芦丁的开发利用报道[17-18]。因此，从烟草废弃物中提取芦丁，不仅可减少环境污染，还能为保健、医药和化工等行业提供原料，实现烟草的综合利用。

本研究利用废弃烟叶作原料，采用超声波辅助提取法，通过单因素试验和响应面优化，考察烟草芦丁提取的因素，确定烟草芦丁提取的最佳工艺，为烟草废弃物的综合利用提供参考。

1材料和方法

1.1材料

供试材料为烟草品种K326调制后的废次烟叶，购自于广东省南雄市湖口镇烟草收购站，干燥粉粹后过20～80目筛，密封保存。

芦丁标准品：生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯化铝、醋酸钠、石油醚、冰乙酸、无水乙醇等均为分析纯：广州化学试剂厂。

SB25-12DT超声清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-2000紫外分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司。

1.2方法

1.2.1标准曲线的绘制

精确称量120℃干燥后的芦丁标准品0.010 5 g，60%乙醇溶解，摇匀，定容至100mL，制成浓度为0.105mg/mL的芦丁标准溶液。精确吸取芦丁标样0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL于6个干净的10mL容量瓶中，分别加入1mL 0.1mol/L三氯化铝和1.5mL 0.2mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液（pH=5.2），摇匀，静置10min，定容，以0号为空白对照，在420 nm波长处测定0～5号标样的吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度（mg/mL）为横坐标绘制出标准曲线，如图1所示。

1.2.2提取方法

精密称取废弃烟叶干燥粉末1 g，置于50mL锥形瓶中，按设定的提取条件（提取温度、提取次数、超声时间、料液比、乙醇体积分数）进行提取，并抽滤得到提取液，测得芦丁的提取量。

1.2.3单因素试验

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curveof rutin

分别以超声时间、提取温度、乙醇体积分数、料液比、提取次数为影响因子，探讨其对芦丁提取率的影响。

1.2.4响应面法优化废弃烟叶中芦丁超声波辅助提取条件

为了选择最优提取条件，依据单因素试验结果，固定提取3次，料液比1∶3（g/mL），根据Box-Behnken实验设计原理[19-20]，选择超声时间、提取温度、乙醇体积分数为因素进行三个水平的中心组合试验如表1，利用Design-Expert软件进行响应面分析以得到芦丁提取的最佳工艺参数。

表1 响应面试验因素水平表Table1 Factor levelof responsesurface

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1乙醇体积分数对芦丁提取率的影响

在固定料液比1∶30（g/mL）、超声时间15min、提取温度50℃、提取次数3次的条件下，不同的乙醇体积分数对芦丁提取率的影响如表2。由表2可知，在乙醇体积分数20%～40%时，随着乙醇体积分数的增加，芦丁提取率增加，在40%时达到最大，能溶于乙醇中的芦丁含量也达到最大。而40%之后提取率呈逐渐下降趋势，当浓度增大时，乙醇挥发增多，一些脂溶性物质溶出影响了芦丁的提取，致使芦丁提取量出现了下降的趋势。所以，选择最佳的乙醇体积分数为40%。

2.1.2料液比对芦丁提取率的影响

在乙醇体积分数40%、超声时间15min、提取温度50℃、提取次数3次的条件下，分别考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）对芦丁提取率的影响，结果如表2所示。由表2中可以看出芦丁得率随溶剂的增加而增加，这是因为溶剂和芦丁的接触面积增大从而使芦丁更易溶出；但当料液比达到1∶30（g/mL）之后，随料液比继续增加而趋于稳定。因此从节约成本的角度考虑，本试验确定料液比1∶30（g/mL）。

表2 单因素试验结果Table2 Resultsof the singer factor experiment

2.1.3超声时间对芦丁提取率的影响

在乙醇体积分数40%、提取温度50℃、提取次数3次、料液比1∶30（g/mL）的条件下，不同超声时间对芦丁提取率的影响如表2。由表2可知，芦丁提取率在15min前随着时间的增加而增加，之后随着时间的增加芦丁得率反而下降。这可能是因为细胞遭到破坏而使芦丁的溶出率增加，但随着时间的增加，超声波对细胞的破碎作用进一步增大，原料中其它醇溶性物质的被溶解提出，使芦丁提取率下降。因此本试验固定超声时间15min。

2.1.4提取温度对芦丁提取率的影响

在乙醇体积分数40%、超声时间15min、提取次数3次，料液比1∶30（g/mL）的条件下，不同提取温度对芦丁提取率的影响如表2。由表2可知，随温度的升高，芦丁提取率也增加，当达到50℃时芦丁的得率达到最大，之后随着温度的增加，芦丁提取率反而有所下降。这种现象是因为高温使芦丁的结构遭到破坏，故提取温度以50℃为宜。

2.1.5提取次数对芦丁提取率的影响

在乙醇体积分数40%、超声时间15min、提取温度50℃、料液比1∶30（g/mL）的条件下，考察不同提取次数对芦丁提取率的影响，结果如表2。由表2可知，随着提取次数的增加，芦丁的提取率有不断增加的趋势，提取次数为4次，得率有所下降，结合得率和效益，已选择提取3次为宜。

2.2响应面结果与分析

2.2.1回归模型的建立与分析

用Design-Expert8.0软件随机产生BOX-Behnken Design试验方案，对考察因素和其水平进行设计，并测得17次的试验结果，并进行多元二次拟合，以芦丁提取液浓度为目标函数的回归方程为：Y=-22.692 5+ 0.513 7A+0.939 0B+0.374 7C-1.223 5×10-3AB+ 8.205×10-4AC-2.356×10-3BC-0.014 45A2-7.482 9× 10-3B2-3.839 4×10-3C2式中的超声时间A、提取温度B和乙醇体积分数C在设计中均经量纲线性编码处理，因此方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。对回归方程方差分析（表3），模型极显著，失拟不显著，R2=0.962 4，RAdj2=0.914 14拟合较好。其中一次项A显著（P＜0.05），B和C极显著（P＜0.01），二次项B2显著（P＜0.05），A2C2极显著（P＜0.01）说明超声时间、提取温度和乙醇体积分数对芦丁提取影响明显。两两项AB和AC不显著（P＞0.05），BC显著（P＜0.05），说明三因素两两之间交互作用中只有提取温度和乙醇体积分数对芦丁提取率的影响达到显著水平。

表3 回归方程模型方差分析Table3 Varianceanalysis for theestablished regressionmodel

2.2.2芦丁提取工艺响应面分析

根据回归方程，作出响应面图和等高线图，考察拟合响应曲面的形状，从中分析超声时间、提取温度和乙醇体积分数对芦丁提取率的影响，如图2～图4所示。3个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，说明响应值存在极高值。3个图中的等高线中心均位于编码值区域内，说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内。等高线的形状可直观反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用较强，而圆形则与之相反。从图2可以看出提取温度的曲面比超声时间的曲面陡，等高线沿提取温度比轴向比超声时间密集，说明超声时间对芦丁提取率的影响比提取温度大；等高线为椭圆形，说明提取温度和超声时间也有交互作用，但对芦丁提取率的影响还没有达到显著水平。

图2 超声时间与提取温度交互作用影响芦丁提取率的等高线图（A）和响应面图（B）Fig.2 Contour（A）and response surfacegraph（B）for theeffects of variableson the lutin yield versusultrasonic timeand extraction tem perature

图3 超声时间与乙醇体积分数交互作用影响芦丁提取率的等高线图（A）和响应面图（B）Fig.3 Contour（A）and response surfacegraph（B）for theeffects of variableson the lutin yield versusultrasonic timeand ethanol volume ratio

图4 提取温度与乙醇体积分数交互作用影响芦丁提取率的等高线图（A）和响应面图（B）Fig.4 Contour（A）and response surfacegraph（B）theeffectsof variableson the lutin yield versusextraction tem peratureand ethanolvolume ratio

从图3可以看出乙醇体积分数的曲面较陡，超声时间的曲面较平缓，说明乙醇体积分数对芦丁提取率的影响显著；等高线沿乙醇体积分数轴向较超声时间轴向密集，说明乙醇体积分数对芦丁提取率的影响比提取时间大，等高线为圆形，说明两因素的交互作用较弱，对芦丁提取率的影响不显著。

从图4可以看出，提取温度和乙醇体积分数的曲面都较陡，说明提取温度和乙醇体积分数都对芦丁提取率显著；等高线沿乙醇体积分数轴向较提取温度轴向密集，说明乙醇体积分数对芦丁提取率影响比提取温度大，等高线为椭圆形，说明两因素的交互作用较强，对芦丁提取率的影响达到显著水平。

2.3废弃烟叶中芦丁最佳提取条件的确定和验证试验

综上所述，可以得出影响芦丁提取率的因素由强到弱依次为乙醇体积分数、提取温度、超声时间。根据回归模型通过Design－Expert软件分析得出，废弃烟叶中芦丁最佳提取工艺参数为乙醇体积分数32.6%、提取温度为57.5℃、超声时间为20.3min。为了方便试验操作取乙醇体积分数33%、提取温度为57℃、超声时间为20min，进行6次验证试验，得到芦丁提取率为13.7mg/g（RSD=0.47%），与预测值13.8mg/g的相对误差为1.0%，预测值与试验值相吻合，说明该优化方法可行。

3结论

近几年，人们开始采用超声波技术提取植物中有效成分，超声波的空化效应击破植物细胞膜，增加溶剂向细胞内扩散和有效成分溶出，从而提高提取效率、缩短提取时间，且对提取物质不产生破坏作用，具有广阔的应用前景。而传统的提取方法提取含量低，时间长等缺点。因此，本试验将超声波法应用到废弃烟叶中提取芦丁，应用响应面分析方法研究几种因素间交互作用，优化废弃烟叶中芦丁超声波提取工艺参数，得到精度高的的回归方程，准确找到提取因素的最佳组合和响应值的最优值：乙醇体积分数32.6%、提取温度57.5℃、超声时间为20.3min。优化后的提取工艺，可以为烟草的综合利用提供参考。

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Study on Optim ization of Ultrasound-assisted Extraction Technology of Rutin from W aste Tobacco Leaves by Response Surface M ethodology

LIHai-yang1，LIYing1，LIRong-hua1，LÜYong-hua2，XIA Yan-shi1，LIZhong3，GUOPei-guo1，*
（1.College of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Guangdong TobaccoMonopoly Administration，Guangzhou 510610，Guangdong，China；3.Collegeof TraditionalChinese Medicine，Guangdong PharmaceuticalUniversity，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Based on single factor experiments for extraction temperature，ultrasonic time and volume ratio of ethanol，the optimum extraction techniquesof rutin from waste leaveswasperformed through the analysisof response surfacemethod（RSM）which was designed by Box-Behnken Design（BBD）.The experimental results showed that the optimum extraction parameterswere as follows：extraction temperature at 57.5℃，ultrasonic time for 20.3min and 32.6%ofethanol volume ratio.The average extraction yield of rutin was 13.7mg/gwith 1.0%of the relative error comparing with the theoretical value，demonstrating that response surfacemethod could effectively optimize the extraction processof rutin from waste tobacco leaves.This resultcould provide references for the comprehensiveutilization of tobaccowaste.

responsesurfacemethodology；waste tobacco leaves；rutin；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.018

2016-11-12

广东省烟草专卖局（公司）科技计划项目（201310）

李海洋（1992—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：烟草生物学。

*通信作者