大孔树脂辅助从葛根中提取葛根素的工艺研究

朱德艳

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

大孔树脂辅助从葛根中提取葛根素的工艺研究

朱德艳

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

以葛根为原料，采取大孔树脂辅助提取葛根素。利用单因素试验和正交试验优化工艺条件。试验结果表明：选择大孔树脂D101型号，葛根与大孔树脂质量比为1∶5，采用浓度为70%的乙醇洗脱，洗脱速度设置为3mL/min时，葛根素的提取率可达1.308%。

葛根素；大孔树脂；提取；正交设计

葛根作为保健食品、功能食品已成当今世界主要发展方向，葛根素类食品已成为世界认可的保健营养品。以葛根为原料分离出来的淀粉和黄酮物质，可制成防治高血压、高血脂、冠心病、糖尿病等功能的清热解毒食品。

葛根素是葛根中的主要活性成分之一，属于黄酮类化合物，化学名为8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7-二羟基异黄酮，分子式为C21H20O9，相对分子质量为416.38。高含量为白色针状结晶粉末，低含量为棕色粉末。在水和有机溶剂中溶解度都不大，加热可溶于水、甲醇、乙醇，但不溶于乙醇乙酯、氯仿、苯。葛根素在临床及保健方面具有很高的利用价值，具有降低血压，减慢心率，降低心肌耗氧量，提高学习记忆能力。在临床上对面运动神经元有保护作用，并且可促进正常人和肿瘤病人的淋巴细胞转化，对干扰素系统有明显的刺激和诱生作用[1-3]。因此中国于1993年批准葛根素注射液作为新药用于临床治疗心脑血管疾病[4]。因此，葛根素作为新型的天然功效因子，在食品工业、医药工业、日用化工工业等方面具有重要的作用。

大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，是在离子交换剂和其它吸附剂应用基础上发展起来的一类新型树脂，主要依靠它和吸附的分子（吸附质）之间的范德华引力，进行物理吸附而达到分离纯化目的[5]。用大孔树脂辅助从葛根中提取葛根素可以充分利用大孔吸附树脂物理吸附这一特点，既不改变葛根素的理化性质和结构，也可以高效地达到纯化分离葛根素的目的。

本研究采用大孔树脂辅助从葛根中提取葛根素，研究了5种不同型号的大孔树脂、葛根与大孔树脂的质量比以及洗脱液乙醇的浓度、洗脱速度对葛根素得率的影响，在进行单因素试验的基础上，设计正交试验，对提取工艺进行优化，探寻大孔树脂辅助超声波法从葛根中提取葛根素的最佳工艺条件。

1材料与方法

1.1材料

葛根：来自湖北省仙之灵有限公司，自然晾干，粉碎；葛根素标准品：购于中国药品生物制品检定所；HCl、氢氧化钠：分析纯，天津市福晨化学试剂厂；D101、AB-8、DM130、HPD100、HPD600大孔树脂：分析纯，郑州勤实科技有限公司；乙醇：分析纯。

1.2主要设备

电子天平：上海上天精密仪器有限公司；DH-600型电热恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；SHZ-DⅢ循环水式多用真空泵：上海予华仪器设备有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海精密实验设备有限公司；KQ-100KDB型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；层析柱：上海亚荣生化仪器厂。

1.3方法

1.3.1葛根素标准曲线的绘制

准确称取葛根素标准品4.04mg，加70%乙醇溶解并稀释至50mL，摇匀。精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL分别置于10mL容量瓶中，各加70%乙醇2mL，再加蒸馏水定容至10mL，摇匀。以2mL 70%的乙醇加蒸馏水至10mL作空白对照，在250 nm波长处测定吸收度，得标准曲线[6-7]。

以葛根素质量浓度（mg/mL）为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线[8]。得到回归方程为Y= 1.089X-0.020 8，R2=0.995 7[9]。

1.3.2样品中葛根素含量的测定

取适量的待测样品，置于圆底烧瓶中，按照1∶3（g/ mL）加入70%乙醇，80℃水浴回流1 h后，过滤，滤渣重复上述操作1次，滤液合并，作为供样品溶液待测。取待测样品溶液1mL置于10mL容量瓶中，加2mL 70%的乙醇，用蒸馏水定容至10mL，250 nm波长处测定吸收度。参照1.3.1中绘制的标准曲线计算样品液中葛根素的浓度C[10]。黄酮提取率计算公式如下：

式中：V为葛根素提取液的体积，mL；M为葛根样品质量，g。

1.3.3大孔树脂的预处理

分别称取大孔树脂D101、AB-8、DM130、HPD100、HPD600各25 g，用1mol/L的NaOH洗涤2 h，过滤后清洗至滤液呈中性，再用1mol/L的HCl洗涤2 h，过滤，清洗至滤液呈中性，纯净水浸泡备用。

1.3.4葛根素的提取工艺

取新鲜葛根，切碎，在电热恒温培养箱中60℃烘干。干燥后的葛根冷却至室温后，用粉碎机磨成粉末，并置于密闭玻璃瓶中，低温避光保存备用。

称取干燥的葛根粉末5.0g于锥形瓶中，加入20mL 70%的乙醇，在频率16 kHz下超声提取40min，静置10min后过滤，收集上清液，加入预处理好的大孔树脂浸泡12 h后装柱，用乙醇作为洗脱剂，考察大孔树脂的型号、葛根与树脂质量比、洗脱剂浓度与洗脱速度对葛根素提取率的影响。

1.3.5单因素试验

大孔树脂型号的确定：称取大孔树脂D101、AB-8、DM130、HPD100、HPD600各25 g，采用浓度为70%的乙醇，3mL/min进行洗脱，收集合并洗脱液，250 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算葛根素的提取率。

葛根与树脂质量比的确定：选择葛根和大孔树脂（D101）质量比分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，用浓度为70%的乙醇作为洗脱剂，洗脱流速3mL/min，收集合并洗脱液，用双光束紫外可见分光光度计在250 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算葛根素的提取率。

乙醇浓度的确定：称取预处理好的D101大孔树脂25 g加入上清液，浸泡12 h后装柱，选择浓度为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇作为洗脱液，洗脱流速3mL/min，收集合并洗脱液，用双光束紫外可见分光光度计在250 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算葛根素的提取率。

洗脱速度的确定：称取预处理好的D101大孔树脂25 g加入上清液，浸泡12 h后装柱，以浓度为70%的乙醇作为洗脱液，选择速度为1、2、3、4mL/min进行洗脱，收集合并洗脱液，用双光束紫外可见分光光度计在250 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算葛根素的提取率。

1.3.6正交试验

为探寻大孔树脂辅助从葛根中提取葛根素的最佳条件，在单因素试验的基础上，选择大孔树脂的型号、葛根与树脂质量比、洗脱剂浓度与洗脱速度作为4个考察因素，以葛根素的提取率为指标，设计L9（34）正交试验来优化大孔树脂辅助从葛根中提取葛根素的条件，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table1 Factorsand levelsin orthogonalarray design

2结果与分析

2.1单基因试验

2.1.1树脂的型号对葛根素提取率的影响

葛根超声波浸提40min后，过滤后取上清液，加入大孔树脂D101、AB-8、DM130、HPD100、HPD600各25 g，浸泡12 h后装柱，用浓度为70%的乙醇作为洗脱剂，洗脱流速3mL/min，收集合并洗脱液，用双光束紫外可见分光光度计在250 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算葛根素的提取率。提取率如下柱形图2。

图1 5种型号的树脂对葛根素提取率的影响Fig.1 Theeffectsof 5 typesof resin on puerarin

由图1可看出，5种大孔树脂在相同条件下对葛根素的吸附能力有较大的差异，其中使用D101大孔树脂使得葛根素提取率明显高于其他4种，因此初步选定D101树脂辅助提取葛根素。

2.1.2大孔树脂的量对葛根素提取率的影响

选用D101型号的大孔树脂，葛根和大孔树脂质量比分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的条件下辅助提取葛根素，提取率如图2。

由图2可看出，当大孔树脂的量不断增加时，葛根素提取率也在增加，但随着大孔树脂的量继续增加时，葛根素提取率增加的幅度不大，为了节约成本，故确定选用5倍质量的大孔树脂来吸附提取葛根素。

2.1.3乙醇浓度对葛根素提取率的影响

称取预处理好的D101大孔树脂25 g加入上清液，浸泡12 h后装柱，洗脱液乙醇的浓度设置为40%、50%、60%、70%、80%，洗脱速度为3mL/min，辅助提取葛根素，提取率如图3。

图3 乙醇浓度对葛根素提取率的影响Fig.3 Theeffectsof ethanolconcentration on puerarin

根据图3可知，乙醇浓度为40%～70%时，随着浓度不断的增加，葛根素的提取率也在不断提高，而乙醇浓度高于70%时，随着浓度的增加，葛根细胞中的脂溶性物质也会渐渐增加溶出量，非提取物的溶出，干扰因素增加，提取率反而下降，故乙醇浓度为70%时提取率最高。

2.1.4洗脱速度对葛根素提取率的影响

称取预处理好的D101大孔树脂25 g加入上清液，浸泡12 h后装柱，洗脱液乙醇的浓度为70%，洗脱速度设置为1、2、3、4mL/min，辅助提取葛根素，提取率如图4。

图4 洗脱速度对葛根素提取率的影响Fig.4 Theeffectsofelution speed on puerarin

根据图4可知，洗脱速度越低，葛根素的提取率越高；随着洗脱速度的加快，提取率降低。但是如果洗脱速度低，洗脱的时间就会延长，从而增加生产的成本，因此要选择合适的洗脱速度也是一个重要的关键点。

2.2正交试验优化葛根素的提取条件

通过对单因素试验结果的分析，为了得到大孔树脂辅助从葛根中提取葛根素的最佳工艺，故考察各个因素水平及他们之间的相互作用，设计L9（34）进行四因素三水平的正交试验，结果见表2。

由表2可看出，由于极差RD＞RC＞RA＞RB，所以影响葛根素提取率的4个因素中依照强弱顺序依次是：D＞C＞A＞B，即洗脱速度＞乙醇浓度＞大孔树脂型号＞葛根与大孔树脂质量比，其中洗脱速度对葛根素的提取率影响最大提取葛根素的最优组合为A3B2C1D3，即：采用D101型号的大孔树脂，葛根与大孔树脂质量比为1∶5，采用浓度为70%的乙醇洗脱，洗脱速度设置为3mL/min。在最佳条件下进行验证试验，葛根素的提取率为1.308%。本试验中使用SPSS软件对所得的结果进行方差分析，见表3。

表2 L9（34）正交试验结果分析Table2 Orthogonalarray design and corresponding experimental results

表3 正交试验方差分析Table3 Varianceanalysisof orthogonalexperiment

结果显示因素A、B、C和D都对葛根素提取率有显著的影响，4个因素对葛根素提取的影响主次顺序为D＞C＞A＞B，与直观分析中极差大小顺序一致。

3结论

大孔树脂辅助提取葛根素的工艺最佳参数为大孔树脂型号为D101、葛根与大孔树脂的质量比为1∶5，洗脱液乙醇浓度为70%、洗脱速度为3mL/min，在此条件下，其葛根素的提取率为可达到1.308%。影响葛根素提取效果的主次顺序是洗脱速度＞乙醇浓度＞大孔树脂型号＞葛根与大孔树脂质量比。

随着新科学技术的不断崛起，对葛根素分离纯化的工艺也越来越多，并且产率也逐渐有所提高。但是目前的很多提取方法仍有很多不足的地方，例如，提取率低，提取的葛根素纯度不高，资源的浪费等。大孔树脂广泛用于中药成分的分离纯化，在使用过程中可以充分利用其物理吸附这一特点，不改变中药成分的理化性质和结构，可以达到高效地纯化生物活性物质的分离的目的[11]。大孔树脂的吸附作用还可以结合传统中医理论和现代化的提取、分离纯化、制剂工艺学[12-13]，改进生物活性物质的生物利用度，从而增强其疗效。大孔树脂辅助提取葛根素，设备要求低，操作简单，可为大规模工业生产提供依据。

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Study on the Technology of Extracting Puerarin from Pueraria radix by M acroreticular Resin

ZHUDe-yan
（CollegeofBioengineering，Jingchu University of Technology，Jingmen 448000，Hubei，China）

Theextractof the Pueraria radix wereused as the rawmaterial to purify puerarinwithmacroreticular resin，based on single factor and orthogonal experiments，extraction purification condition was optimized.The resultsshowed that theoptimum condition aremacroreticular resin D101，Radix Pueraria tomacroreticular resin 1∶5，ethanol concentration 70%，elution speed 3mL/min.Under the optimized conditions，the extraction yield ofpuerarin isup to1.308%.

puerarin；macroreticular resin；extraction；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.016

2016-06-17

荆楚理工学院湖北省新农村发展研究院项目（Z201404）

朱德艳（1977—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：生物制药技术。