枫糖的遗传毒性及亚慢性毒性试验研究

宋昕恬，孟令仪，张晶莹，周博宇，张琨

（1.吉林省疾病预防控制中心毒理所，吉林长春130062；2.吉林大学第二医院，吉林长春130000）

枫糖的遗传毒性及亚慢性毒性试验研究

宋昕恬1，孟令仪1，张晶莹1，周博宇1，张琨2，*

（1.吉林省疾病预防控制中心毒理所，吉林长春130062；2.吉林大学第二医院，吉林长春130000）

评价枫糖的食用安全性。急性毒性试验，采用限量法，将小鼠禁食（不禁水）16 h后，经口灌胃给予受试物，剂量为15.0 g/kgBW，灌胃后观察14 d；细菌回复突变试验，设5 000、1 000、200、40、8μg/皿5个剂量组，及未处理、溶剂、阳性对照组，采用平板掺入法，对有组氨酸营养缺陷的5株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535进行回变菌落计数；哺乳动物红细胞微核试验，设10.0、5.0、2.5 g/kgBW三个剂量组，环磷酰胺及阴性对照组，采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验，计数骨髓嗜多染红细胞在总红细胞的比例及含微核嗜多染红细胞比率；90天喂养试验，设8.0、6.0、4.0g/kg BW三个剂量组，掺入饲料喂养90 d，空白对照组给与正常饲料，观察体重、食物利用率、血常规、血生化指标及病理检测。枫糖细菌回复突变试验、骨髓细胞微核结果均为阴性，90天喂养试验各项指标与对照组比较无显著性差异。枫糖在一定剂量范围内通过系统的体内和体外试验验证其具有食用安全性。

枫糖；大鼠；遗传毒性；亚慢性毒性

在枫树的树液中可提炼出一种糖分，被当地人称之为枫糖，用它替代蔗糖加工食品，既增加了矿物质又降低了热量，并且它富含的酚苷成分有抗肿瘤作用，现已成为食品加工原料的新宠[1-2]。有研究表明深色枫糖含有的有益成份更适合应用于开发功能食品及食品添加剂[3]。但是对于枫糖的遗传毒性及亚慢性毒性未见相关报道，并且，根据《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知卫法监发[2002]51号》文件，它并不在既是食品又是药品的物品名单及可用于保健食品的物品名单中。卫生部批准的新资源食品目录中，枫糖也未获得批准。本实验室根据食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序2014及2003版[4-8]，对其进行了细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验及90天喂养试验。

1材料和方法

1.1试剂与仪器

枫糖（粉末状）：由创喜（北京）医药科技有限公司提供；GR60DA型立式压力蒸汽灭菌仪：致微（厦门）仪器有限公司产；DH-500A型电热恒温培养箱：上海基玮试验仪器设备有限公司产；SYSMEX-XT2000i型全自动血液分析仪：日本；血常规检测试剂盒：由上海科华东菱诊断用品有限公司提供；TBA-120FR型全自动生化分析仪：日本东芝；血生化检测试剂：由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供；环磷酰胺：由FLUKA公司提供；酪蛋白（纯度为98.0%）：由南京泽朗医药科技有限公司生产。

1.2实验动物

SPF级ICR小鼠，雌、雄各25只，体重25.0g～30.0g，SPF级Wistar大鼠，雌雄各40只，体重65.0 g～85.0 g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，批准证号为SCXK-（吉）2011-0004。本实验动物环境设施合格证，吉动设字10-1005；实验动物使用许可证号，SYXK-（吉）2010-0011；温度20℃～22℃、湿度55%～65%。

1.3方法

1.3.1急性毒性试验

采用限量法，将小鼠禁食（不禁水）16 h后，按体重要求选取雌、雄各10只，经口灌胃给予受试物，剂量为15.0 g/kg BW（取37.5 g样品溶于蒸馏水至50.0mL混匀达可灌胃最大浓度75%，灌胃1次，灌胃量0.2mL/ 10 g BW）。观察14 d。主要观察小鼠的中枢神经系统及躯体运动有无改变姿势、叫声异常、运动失调等；自主神经有无瞳孔放大或缩小、流涎、流泪等；呼吸系统有无流鼻涕、潮式呼吸等；胃肠系统有无气胀、腹泻或便秘等。并记录出现中毒症状的时间。如果动物有死亡，记录死亡数、死亡时间，对全部动物做大体解剖，并在第14天称量体重，计算增重。

1.3.2细菌回复突变试验

选取TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535五种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株。在本实验室经过鉴定后，生物学性状均符合要求。测试菌液浓度大于等于1×109活菌数/mL。试验剂量分为5 000、 1 000、200、40、8μg/皿5组，取5.0 g枫糖加蒸馏水至100mL，均匀混合后浓度为5 000μg/皿，其余4组剂量均按照1/5倍比递减稀释；受试液经过20min，121℃，0.103MPa高压灭菌后使用；另设阳性对照组、溶剂对照组及未处理对照组。在顶层琼脂中加入试验菌株增菌液、枫糖溶液各0.1mL，代谢活化时加入代谢活化系统S9混合液0.5mL并混合均匀后倒入底层培养基平板。37℃培养箱中培养48 h后计数每皿回变菌落数。如果受试物回变菌落数是自发回变菌落数的2倍以上，并具有剂量--反应关系可定为阳性。每个剂量组做3个平行板，并在相同实验条件下重复做2次，最后分别统计结果。

1.3.3哺乳动物红细胞微核试验

设10.0、5.0、2.5 g/kg BW三个剂量组（分别取25.00、12.50、6.25 g受试物溶于蒸馏水至50mL混匀），另设阴性对照组（蒸馏水）、阳性对照组（环磷酰胺40mg/kg BW：取100mg环磷酰胺加入生理盐水至50 mL混匀），选取两次经口灌胃间隔24 h进行的试验方法，灌胃量为0.2mL/10 g BW。在末次灌胃6 h后，颈椎脱臼处死小鼠，取股骨挤出骨髓液与小牛血清混合常规涂片，用甲醇固定后，放入Giemsa染液中染色。用光学显微镜观察每只小鼠骨髓红细胞200个，计数嗜多染红细胞所占的比例；观察嗜多染红细胞（PCE）2 000个，计数微核嗜多染红细胞频率，即含微核细胞率，以千分率表示。

1.3.4 90天喂养试验

购买动物后在本实验室饲养观察3 d，随机分为3个不同剂量试验组及对照组，每组20只雌雄各半。枫糖成人每日推荐摄入量为2.15 g/60 kg BW，高、中、低剂量组摄入量为8.00、6.00、4.00 g/kg BW，分别相当于成人摄入量的223、167、112倍。将3个试验组的枫糖按计量均匀掺入基础饲料中，含量依次为10.0%、7.5%、5.0%（受试样品分3次配制，每次20 kg）。对照组给与基础饲料。大鼠饲料摄入量按体重8%计算，单笼饲养，自由饮食，记录大鼠体重、进食量，连续观察90 d。高、中、低剂量组受试物中补充一定量的酪蛋白，分别为478、358、239 g，使得高、中、低剂量组蛋白含量和对照组一致，同为18.9%。观察记录大鼠一般行为表现、中毒症状及死亡情况，每周称取体重1次、摄入量2次并计算每周食物利用率及总食物利用率。试验中期尾静脉采血，检测血液学及血生化指标，包括RBC、Hb、WBC及其五分类，ALT、AST、UREA、Cr、Glu、TP、Alb、TC、TG。试验第90天禁食16 h，于试验91天称重，按照5.0mL/kg BW腹腔注射1%戊巴比妥钠生理盐水溶液麻醉后，下腔静脉采血，检测血液学及血生化指标。对大鼠进行大体解剖，称取脏器绝对重量计算相对重量即脏体比，并对肝、脾、肾、胃、十二指肠、睾丸或卵巢进行组织病理学检查。

1.4统计方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计，方差齐时，采用LSD法；方差不齐时，采用Tamhane’s法对各组间进行两两比较。

2结果

2.1急性毒性试验

试验期间，每只小鼠均未见中毒症状，死亡数为零，雌、雄性小鼠：限量法LD50＞15.0 g/kg BW，根据急性毒性半数致死剂量分级属无毒级。

2.2细菌回复突变试验

将枫糖在鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535进行平板掺入试验，结果见表2和表3。

表1 第一次细菌回复突变试验结果（±s）Table1 Resultsof the firstbacterial reversemutation test（±s）

表1 第一次细菌回复突变试验结果（±s）Table1 Resultsof the firstbacterial reversemutation test（±s）

TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535不加S9加S9不加S9加S9不加S9加S9不加S9加S9不加S9加S95 000 124.3±7.2 117.3±10.0 32.3±5.0 31.3±4.0 156.0±4.4 165.0±5.2 282.3±7.5 277.0±7.9 20.3±6.1 22.0±4.4 1 000 114.3±11.0 123.3±9.0 37.0±4.4 32.3±5.8 154.3±9.3 164.3±9.1 268.3±7.0 278.3±11.9 14.3±3.8 21.0±4.4 200 116.0±6.6 117.3±11.0 36.0±2.0 36.3±4.0 159.0±9.5 157.0±13.9 286.3±5.1 282.7±8.1 17.3±4.0 19.3±4.0 40 121.7±8.5 121.6±6.5 36.7±3.1 35.7±4.0 170.7±4.5 166.0±11.1 269.7±5.5 269.0±6.6 20.0±4.6 21.7±5.1 8 120.0±8.0 126.3±6.5 33.7±2.1 34.3±5.1 160.3±13.3 162.3±7.1 276.3±13.5 277.3±11.2 18.3±3.2 21.3±6.7未处理对照124.7±4.0 120.7±9.3 34.0±3.6 35.0±6.1 163.7±10.3 170.0±4.6 289.7±5.1 282.0±8.2 22.7±2.3 18.7±2.9溶剂对照115.0±7.0 125.7±9.3 37.7±2.5 31.0±6.1 156.7±11.0 166.7±13.7 278.0±9.5 274.3±13.6 23.7±8.1 19.7±8.0阳性对照1 274.7±99.3 1 349.0±80.3 1 900.3±107.9 2 031.7±92.4 1 200.3±66.3 1 363.7±50.3 1 180.7±37.6 1 005.0±48.8 450.7±72.5 228.7±63.7剂量/（μg/皿）

表2 第二次细菌回复突变试验结果（±s）Table2 Resultsof second bacterial recovery test（±s）

表2 第二次细菌回复突变试验结果（±s）Table2 Resultsof second bacterial recovery test（±s）

TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535不加S9加S9不加S9加S9不加S9加S9不加S9加S9不加S9加S95000 122.7±4.6 120.7±11.4 35.7±4.2 36.7±3.2 157.7±7.0 162.7±6.0 285.0±7.2 268.7±8.1 15.0±5.6 23.7±7.4 1000 116.0±9.5 118.7±12.1 34.3±5.1 36.0±6.1 162.3±11.0 169.3±7.0 269.3±10.0 277.3±11.9 16.0±7.2 20.3±4.5 200 113.3±9.1 121.7±9.3 30.7±2.5 38.3±2.5 163.3±6.0 157.3±8.4 276.7±10.6 285.7±6.8 21.0±7.9 24.3±6.4 40 120.7±9.5 119.7±11.4 34.0±3.6 36.3±5.0 161.0±12.1 158.3±8.4 278.0±9.2 280.0±14.4 18.0±3.6 19.7±4.7 8 118.0±12.1 124.7±4.0 36.7±4.0 30.7±2.5 164.3±8.5 162.0±10.8 269.0±11.5 272.0±8.9 22.7±5.1 25.0±5.6未处理对照120.0±6.2 126.3±5.9 35.7±5.1 32.0±3.0 156.0±7.0 165.3±4.2 270.3±9.3 271.0±10.4 19.3±3.1 16.7±2.9溶剂对照116.0±11.8 121.0±8.7 34.7±2.9 35.3±3.2 158.7±8.6 162.0±6.0 275.0±6.0 283.7±5.0 24.7±3.8 19.0±4.4阳性对照1 360.3±102.3 1 406.0±144.0 1 882.3±65.1 2 085.7±33.5 1 178.3±128.4 1 277.3±97.9 1 237.7±73.1 1 041.0±61.5 475.7±35.2 256.3±54.5剂量/（μg/皿）

在加和不加S9混合液的情况下，8μg/皿～5 000μg/皿5个剂量组均未引起试验菌株的回复突变菌落数显著增加，判断细菌回复突变试验结果为阴性。

2.3哺乳动物红细胞微核试验

10.0、5.0、2.5 g/kg BW三个剂量组微核细胞率与阴性对照组比较差异无显著性（P＞0.05）；阳性对照组与阴性对照组比较差异有显著性（P＜0.01），各剂量组PCE/NCE比值均不少于对照组的20%。提示枫糖骨髓细胞微核试验结果阴性，各组动物未见细胞毒性作用。

2.4 90天喂养试验

2.4.1一般情况观察及对体重、饮食的影响

试验期间大鼠生长状态良好，饮食及日常行为表现未见异常，未见中毒及死亡。各组间体重、饲料摄入量、食物利用率及大鼠脏体比未见显著性差异（P＞0.05）。

2.4.2对血液学及各项生化指标的影响

90天喂养试验中期及末期分别对大鼠的血红蛋白、红细胞、白细胞及白细胞的五分类进行检测；同时还对大鼠的九项生化指标（ALT、AST、BUN、Cr、GLU、TP、ALB、TC、TG）进行检测。各项指标均在本实验室历史正常值范围内，与对照组比较，未见显著性差异（P＞0.05）。部分检测结果见表3。

2.4.3病理学检查结果

90天喂养试验病理学检查结果见图1～图12。

表3 90天喂养试验中期及末期雄性血液学检查结果（±s）Table3 Resultsof 90-day feeding test in them id and late-stagemalehem atology test（±s）

表3 90天喂养试验中期及末期雄性血液学检查结果（±s）Table3 Resultsof 90-day feeding test in them id and late-stagemalehem atology test（±s）

白细胞分类/% LYMP MONO NEUT EO BASO中期雄性对照组10 147.20±5.75 8.03±0.29 5.13±0.68 79.25±2.39 2.63±0.49 17.04±2.08 1.08±0.30 0.00±0.00高剂量组10 143.20±5.39 7.76±0.29 5.88±0.78 79.23±3.06 2.77±0.50 16.84±1.25 1.15±0.28 0.01±0.03中剂量组10 143.90±7.49 7.87±0.39 5.94±1.00 79.56±3.00 2.91±0.98 16.48±1.33 1.01±0.33 0.04±0.07低剂量组10 145.80±6.27 7.98±0.30 5.30±0.98 78.82±3.44 2.62±0.33 17.55±1.54 1.00±0.33 0.01±0.03末期雄性对照组10 145.10±6.54 8.36±0.55 5.05±0.70 78.28±2.24 3.10±0.85 17.47±1.70 1.15±0.31 0.00±0.00高剂量组10 142.00±5.70 8.18±0.59 5.30±0.73 77.28±2.81 3.89±1.10 17.37±1.40 1.32±0.36 0.04±0.08中剂量组10 143.90±5.65 8.30±0.43 5.16±0.79 78.36±2.31 3.89±1.18 16.38±2.01 1.37±0.28 0.00±0.00低剂量组10 144.80±6.14 8.22±0.61 5.22±0.93 78.49±3.17 3.16±0.85 17.21±1.98 1.14±0.21 0.00±0.00性别剂量组动物数/只血红蛋白/（g/L）红细胞/（×1012/L）白细胞/（×109/L）

表4 90天喂养试验中期及末期雄性生化检验结果（±s）Table4 Resu ltsof 90-day feeding test in them id and late-stagemalebiochem ical test（±s）

表4 90天喂养试验中期及末期雄性生化检验结果（±s）Table4 Resu ltsof 90-day feeding test in them id and late-stagemalebiochem ical test（±s）

TG/（mmol/L）中期雄性对照组10 29.4±3.9 90.7±8.2 5.13±0.77 56.9±4.4 5.37±1.02 56.2±3.6 32.5±1.9 1.83±0.17 0.52±0.09高剂量组10 30.5±5.5 91.2±9.0 5.13±0.77 56.4±5.1 5.94±0.92 57.5±4.2 32.7±2.2 1.85±0.17 0.56±0.07中剂量组10 28.9±4.4 88.8±7.5 5.53±0.65 55.6±4.6 5.80±0.80 55.8±4.5 32.6±2.4 1.83±0.14 0.54±0.10低剂量组10 28.4±5.7 90.2±8.2 5.45±0.79 57.3±4.2 5.74±0.67 56.8±4.5 31.9±1.9 1.86±0.12 0.56±0.10末期雄性对照组10 30.3±3.6 96.3±8.4 5.76±0.87 60.5±3.5 6.26±0.78 60.6±3.7 36.0±2.0 2.17±0.13 0.62±0.11高剂量组10 31.2±3.3 102.2±11.3 5.97±0.93 61.2±3.0 6.02±1.07 61.9±3.8 37.0±2.0 2.17±0.17 0.70±0.07中剂量组10 30.4±3.9 99.6±11.3 5.64±0.84 62.8±3.3 6.06±0.97 61.8±3.3 36.6±2.3 2.22±0.16 0.64±0.11低剂量组10 29.5±4.0 102.9±8.1 5.73±0.73 59.5±3.0 6.21±0.72 60.6±3.9 36.3±2.6 2.15±0.15 0.67±0.07性别剂量组动物数/只（U/L）AST/（U/L）UREA/（mmol/L）ALT/Cr/（μmol/L）（mmol/L）TP/（g/L）Alb/（g/L）TC/（mmol/L）Glu/

图1 肝脏（对照组）Fig.1 Liver（controlgroup）

图2 肝脏（高剂量组）Fig.2 Liver（high dosegroup）

图3 脾脏（对照组）Fig.3 Sp leen（controlgroup）

图4 脾脏（高剂量组）Fig.4 Spleen（high dosegroup）

图5 胃（对照组）Fig.5 Stomach（controlgroup）

图6 胃（高剂量组）Fig.6 Stomach（high dosegroup）

图7 肾脏（对照组）Fig.7 K idney（controlgroup）

图8 肾脏（高剂量组）Fig.8 K idney（high dosegroup）

3个剂量组（分别为人体摄入量的223、167、112倍）与对照组雌、雄性大鼠在实验期间未见躯体运动及神经系统异常，毛发光泽、未见流涎、流涕、流泪，排泄物无异常，各组间大鼠体重未见明显差异。对各组大鼠脏器进行大体解剖观察未见异常改变。高剂量组及对照组40只大鼠（雌、雄各半）的肝、脾、肾、胃、十二指肠、性腺（睾丸或卵巢）经病理学检查均未见与枫糖相关的病理改变，故未对中、低剂量组大鼠作组织病理学观察。

图9 卵巢（对照组）Fig.9 Ovary（controlgroup）

图10 卵巢（高剂量组）Fig.10 Ovary（high dosegroup）

图11 睾丸（对照组）Fig.11 Testis（controlgroup）

图12 睾丸（高剂量组）Fig.12 Testis（high dosegroup）

3讨论

本试验根据2014年颁布的GB 15193.1-2014《食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序》对枫糖进行了遗传毒性及亚慢性毒性检测。急性毒性试验可以在短时间内观察动物产生的毒性反应，结果为无毒级。细菌回复突变试验检测枫糖对微生物（细菌）的基因突变作用，预测其遗传毒性和潜在的致癌作用；哺乳动物红细胞微核试验通过分析动物骨髓红细胞，检测枫糖是否引起成熟红细胞染色体损伤或有丝分裂装置损伤，预测其致突变性。这两项遗传毒性试验结果均为阴性，提示枫糖对基因哺乳类动物体细胞染色体无损伤作用[9]。90天喂养试验通过长期喂饲不同剂量的枫糖，检测其对动物引起的有害效应的剂量、毒作用性质和靶器官，估计亚慢性摄入的危害性，结果显示各剂量均未观察到其对大鼠生长发育、血常规、血生化及病理检测等指标有异常影响。枫糖在本试验剂量范围内未观测到致突变性及毒性作用，为对其进行进一步的开发研究，纳入保健食品及新资源食品名录，提供理论依据。

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Study on Genetic Toxicity and Sub Chronic Toxicity Text of M ap le Sugar

SONGXin-tian1，MENG Ling-yi1，ZHANG Jing-ying1，ZHOUBO-yu1，ZHANGKun2，*
（1.Disease ControlPrevention of Jilin Province，Changchun 130062，Jilin，China；2.The Second Hospitalof Jilin University，Changchun 130000，Jilin，China）

The purposeof the presentstudywas to investigate the toxicity ofmaple sugaron rats.Acute Toxicity test：Used limitedmethod，ICRmice after a fastof16 h，can nothelp butwater，observed in 14 days after given subjectsby oral in 15.0 g/kg BW dose.Ames test：Setup 5 000，1 000，200，40，8μg/dish 5 dose groups，untreated group，solventgroup，positive controlgroup.Used plate incorporationmethod，counted thenumberof reverse colonieswith 5 kinds of histidine nutrition deficiency Strain TA97，TA98，TA100，TA102 and TA1535. Mammalian ErythocyteMicronucleus test：Seted 10.0，5.0，2.5 g/kg BW three dose groups，cyclophosphamide group and negative control group.Two oral administration during 24 h.calculated proportion of bonemarrow polychromatic erythrocytes in total red blood cells.90 day feeding test：Seted 8.0，6.0 4.0 g/kg BW three dose groups.Mixed feed for90 days，blank controlgroupwasgiven normal feed.Observed bodyweight，food utilization，blood routine，blood biochemical indexes and pathological examination.The result of Ames text and Mammalian Erythocyte Micronucleus testofmaple sugarwasnegative.Therewasno significantdifference compared to blank controlgroup aboutvarious index of90 days feeding text.Maple sugar is confirmed edible safety by system tests in vivoand in vitro testata certain dose range.

maplesugar；rat；genetic toxicity；sub chronic toxicity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.008

2016-06-14

宋昕恬（1979—），女（汉），副主任医师，硕士，主要从事食品毒理学研究。

*通信作者：张琨（1968—），女（汉），主任医师，博士，主要从事毒理学研究。