植物细胞程序性死亡检测技术研究进展

邓雨青 李平 周彦 熊克才 李中安

（1. 西南大学柑桔研究所 中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712；2. 重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室 西南大学植物保护学院，重庆 400716）

植物细胞程序性死亡检测技术研究进展

邓雨青1李平1周彦1熊克才2李中安1

（1. 西南大学柑桔研究所 中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712；2. 重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室 西南大学植物保护学院，重庆 400716）

细胞程序性死亡（PCD） 是一种细胞生物学反应，广泛存在于植物的生长发育与抗逆过程，是当今生命科学的研究热点之一。从形态学、生物化学和分子生物学等方面综合分析了植物细胞 PCD 检测方法的研究进展，并对现有植物 PCD 检测技术的不足和解决途径进行了讨论与展望，以期为后续 PCD 研究和应用提供借鉴。

细胞程序性死亡 ；细胞凋亡 ；检测技术

细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）也称细胞凋亡（apoptosis），是细胞在特定生理或病理条件下，由基因调控的一种生物学现象［1］。PCD是植物生长发育过程的重要组成部分，贯穿胚发育，细胞分化及器官形成等过程［2］。同时，PCD 也是植物抵御生物或非生物胁迫的基本机制，在植物抗病或抗逆过程中发挥着重要的作用［3，4］。

细胞死亡主要分为 PCD 和细胞坏死。前者主要表现为细胞体积缩小、细胞核浓缩、线粒体产生空泡或解体、液泡破裂等，通常无炎症反应。坏死细胞的主要特征为细胞肿胀、细胞膜破裂、胞浆内容物外流，并伴有炎症发生［5］。两者易被混淆，因此正确辨别 PCD 细胞和坏死细胞是研究植物 PCD 的前提。早期常采用光学显微镜及电子显微镜进行形态学观察，或通过琼脂糖电泳法检测 DNA 片段化。近年来，分子生物学、细胞生物学技术被逐渐运用于植物 PCD 的检测，手段已日趋成熟，极大地提高了检测的准确性和效率。本文对 PCD 检测技术的研究进展进行综述，并分析了现有检测技术的不足及展望今后发展方向，旨在为相关研究提供参考。

1 形态学检测方法

植物细胞发生 PCD 时会出现细胞质、细胞核皱缩，染色质高度凝聚并且边缘化，内质网扩增，线粒体肿胀，液泡破裂等典型的形态变化［5，6］。利用光学显微镜、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和电子显微镜可观察到发生 PCD 的植物细胞。

1.1 光学显微镜检测

植物组织样品经伊文思蓝、台盼蓝、甲基绿-派诺宁等染料染色处理后，通过光学显微镜观察细胞体积缩小、凝聚、边缘化及凋亡小体形成等形态变化可快速判断 PCD 的产生。该方法虽然简便，但灵敏度低，无法检测 PCD 发生初期的细胞，且难以区分 PCD 细胞与凝固性坏死细胞［7］。因此光学显微镜法只能用于植物细胞 PCD 的初步判别，不能单独使用，需与其他检测手段相结合。

1.2 荧光显微镜检测

与坏死细胞不同，PCD细胞和正常细胞的细胞膜完整，没有损伤。此外，PCD细胞与正常细胞相比，常常会出现染色质凝聚且边缘化的现象。因此，根据细胞膜完整性和核内染色质发生凝聚的特点，借助 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、Hoechst、吖啶橙 (acridine orange，AO)、碘化丙啶 （propidium iodide，PI） 和溴乙锭 （ethidium bromide，EB） 等 DNA 特异性染料，在荧光显微镜下可有效区分正常细胞、坏死细胞及PCD 细胞。Pang 等［8］通过 DAPI 染色观察到经低氧水处理的小麦根尖细胞出现了原生质浓缩、染色质凝集、细胞核皱缩等典型的 PCD 特征。PI 与 EB 进入细胞膜显色后只能区分活细胞与死细胞，因此通常采用双重染色法区分 PCD 细胞、正常细胞和坏死细胞。李荣峰等［9］以大豆根边缘细胞为材料，利用Hoechst-PI 双重荧光检测铝诱导的细胞程序性死亡发现，活细胞中有淡蓝色荧光，而 PCD 细胞的细胞质呈黄绿色、细胞核呈黄色，坏死细胞则显示金黄色荧光。Kunikowska 等［10］在利用EB/AO双重荧光检测激动素诱导的蚕豆根尖细胞 PCD 时，发现活细胞的细胞核出现均匀分布的黄绿色荧光，细胞质显示橘红色荧光。PCD 早期细胞核染色质呈黄绿色并且凝聚在核膜内侧，晚期 PCD 细胞被染成橙色。该方法简便易行，应用较广，是常用的植物细胞 PCD检测方法，但定量和定性均较差。

1.3 激光共聚焦显微镜检测

激光共聚焦显微镜法是目前应用最广泛和光学图像分辨率最高的分子细胞生物学分析方法，因其具有较高的分辨率、灵敏度、放大率等特点，广泛应用于植物 PCD 研究。通过激光共聚焦显微镜观察细胞的结构变化，对 PCD 细胞的染色质和核碎片进行定位，同时利用荧光标记还可以观察 PCD 细胞内的信号转导过程，从而对细胞内环境的动态变化进行实时监测。方策等［11］利用该技术研究伏马菌素B1（fumonisin B1，FB1）诱导拟南芥 PCD 时发现早期 PCD 细胞线粒体中过氧化氢含量急剧增加，同时线粒体发生肿胀，引发线粒体膜电位下降。Wang［12］利用该方法检测家榆老化的种子发现，经DAPI 染色后种子细胞中呈染色质皱缩、凝聚、解体等特征，表明榆树种子在老化过程中发生了 PCD。该方法可用于组织切片、固定后的细胞，以及体外培养的悬液细胞观察，灵敏度高，特异性强。

1.4 电子显微镜检测

利用电子显微镜技术观察植物 PCD 细胞形态学特征，是诊断 PCD 最可靠的方法之一。扫描电镜可以观察到 PCD 细胞表面发生的细胞体积缩小，细胞表面微绒毛减少等形态变化［13］。而透射电镜则用于观察 PCD 细胞内部超微结构的变化，如细胞质浓缩、内质网扩增和线粒体肿大、细胞核染色质凝聚、边缘化、形成凋亡小体等［5，14］。Rybaczek 等［15］利用透射电镜观察咖啡碱诱导蚕豆根尖分生组织 PCD 时发现，细胞出现大范围液泡化、染色质凝聚且边缘化、囊泡增加、原生质体收缩等典型 PCD 特征。但是电子显微镜不能对 PCD 细胞进行定量，同时样品制备过程较复杂，检测成本较高、耗时长，不适宜大批样品观察。

2 染色质 DNA 断裂检测方法

2.1 DNA 梯状条带检测

植物细胞发生 PCD 时，核酸内切酶活性增加，细胞核 DNA 在核酸内切酶的作用下，在核小体间断裂形成具有 180-200 bp 及其倍数的 DNA 片段，从而在琼脂糖凝胶电泳上呈现特殊的 DNA 梯状条带［16-18］。坏死细胞DNA由于被无规则破坏而产生散漫的片状图谱［15］。在水分胁迫的玉米叶片［16］、铝诱导的玉米根尖细胞［3］、冷害胁迫的黄瓜果实［17］和激动素诱导的蚕豆根尖细胞［11］发生 PCD 时都可以检测出明显的 DNA 梯状条带。但并非所有发生PCD 的细胞都能观察到 DNA 梯状条带。金钢［19］和范涛等［20］分别研究线虫侵染的黑松及褐斑病菌侵染的苹果叶片的 PCD 时，虽检测到 DNA 片段化存在，却没有观察到 DNA 梯状条带，这可能是样品中发生 PCD 的细胞少，断裂的DNA含量较低，不易被检测到。该方法操作简便，定性准确，可定量检测晚期PCD 细胞。但灵敏度低，不能检测 DNA 断裂较少的早期 PCD 细胞，也不能显现组织细胞形态结构，需与其他检测方法结合使用。

2.2 彗星电泳检测

彗星电泳（comet assay）也称单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis，SCGE），是一种定量测定 DNA 损伤的可靠方法，主要用于检测单细胞中 DNA 损伤因子引发的细胞 DNA 断裂片段。该方法由 Ostling和Jahanson［21］于1984年建立，后经Singh等进行了改进［22］。其原理是 DNA 双链在碱性电泳中解螺旋，断裂的 DNA 碎片释放并向阳极移动，经荧光染色观察呈现“彗星”状。DNA 损伤越重，断裂的 DNA 碎片就越多，导致尾部 DNA 聚集，荧光增强。因此可通过 DNA 迁移距离或者荧光强度测定细胞 DNA 的损伤程度。早期彗星电泳多用于动物细胞PCD的检测，直到 1996年Koppen等［23］首次利用 SCGE 检测蚕豆根尖细胞 DNA 损伤，随后该方法在多种植物中得到应用。蒋磊等［24］在此基础上完善了植物材料的 SCGE 技术，研究了紫外辐射诱导后不同发育时期的九里香叶片 DNA 损伤的敏感性差异。Rybaczek 等［15］也利用该方法检测到咖啡碱处理的蚕豆根尖分生组织中存在 DNA 损伤。彗星电泳法快速、简便、准确，不仅可以检出单、双链断裂，同时对碱基易变位点，DNA 交联、切除修复位点也有良好的检测效果。但是不能直接检测具有细胞壁的植物细胞，多用于植物原生质体的检测。

2.3 TUNEL 原位末端标记检测

TUNEL 原位末端标记法是一种检测 DNA 片段3'末端羟基的方法，可通过对完整的PCD 细胞核或凋亡小体进行染色观察，从形态学和生物化学方面反映植物 PCD 的过程。植物细胞发生 PCD 时，核酸内切酶被激活，染色质DNA被切割而形成单链或双链缺口，其末端暴露出大量的 3'-OH，在末端脱氧核酸转移酶（TdT）作用下，DNA 末端的羟基与荧光素-12dUTP 结合，从而检测出 PCD 细胞。在荧光显微镜下，经荧光素标记后的 PCD 细胞细胞核呈现较强的绿色荧光，正常细胞与坏死细胞因 DNA断裂很少，几乎没有荧光［16，26］。应用该方法发现铝、咖啡碱、胡桃醌、SQ-1 分别诱导花生细胞、小麦叶片、莴苣幼苗根尖细胞及蚕豆根尖细胞发生PCD［3，14，26，27］。与其他检测方法相比，TUNEL 法特异性强，灵敏度高，可对 PCD 细胞进行定性与定量分析，甚至能检出早期未发生典型变化的 PCD 细胞，主要用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞以及组织中分离细胞的 PCD 检测，是目前检测植物 PCD 的首选方法。

2.4 ELISA 法检测

植物发生 PCD 时，染色质 DNA 断裂在细胞质中出现核小体或寡聚核小体片段，通过 ELISA 检测PCD 细胞释放到细胞质中的核小体片段确定细胞发生 PCD 的程度。早期ELISA主要用于动物细胞的检测，直到 2000 年 Ning 等［28］首次将其运用于植物PCD研究。随后 Tulliicristiance 等［29］运用该方法检测到茜草科作物黏液毛细胞中存在 PCD。该方法简便易行，灵敏性高，最低可检测500个/mL PCD 细胞，适合大批量样本的检测，但不能进行定位。

2.5 流式细胞仪检测

流式细胞仪（flow cytometry，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行快速定量分析和分选的检测方法，主要用于细胞定量分析和细胞分类研究。植物 PCD 细胞会出现 DNA 断裂现象，利用 FCM 观察荧光素染色后的细胞发现，在DNA 分布直方图上可看到正常细胞G1期的峰前增加了一个特异性二倍体亚峰，同时根据峰的高低测出 PCD 细胞的百分率［30，31］。此外，由于 PCD 细胞具有低于正常细胞的前散射光谱和高于正常细胞的侧散射光谱，而坏死细胞则具有明显高于正常细胞的前、侧散射光谱，因此利用 FCM 观察光散射特征可辨别、定量 PCD 细胞。流式细胞仪检测法操作快捷、简便，灵敏度高，特异性强，结果准确，且所需样品量少，可同时测定细胞增殖率和死亡率，但该方法只能检测单个细胞或生物粒子，且对生物样品的质量要求也较高。

3 其他检测方法

3.1 Caspase 活性检测

Caspase 是一类半胱氨酸蛋白酶，是调控动物PCD 的关键因子。近年研究发现，在发生 PCD 的植物细胞中检测到类似 Caspase 酶的活性［32，33］。Ma［34］在研究水分胁迫下湖北海棠根系 PCD 时，检测到了Caspase-3 与 Caspase-7 的活性。谭冬梅［35］利用免疫印迹法检测干旱胁迫诱导平邑甜茶及新疆野苹果的 PCD 时发现，两种砧木叶中都含有类 Caspase-3蛋白酶，其分子量约 40 kD，比动物 Caspase-3 酶高8 kD。徐其现［36］等通过构建类 Caspase-3 蛋白酶的表达载体，并运用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术检测到植物PCD过程中 Caspase-3 的活性。目前可通过荧光底物以及 Caspase 酶抑制剂检测植物 PCD 中类 Caspase蛋白酶活性和功能，也可以通过蛋白印迹法（western blot）检测 PCD 细胞内 Caspase 裂解产物。Caspase活性检测法操作简单，可操作性强，可用于大批样品的检测。

3.2 线粒体膜电位检测

线粒体在植物 PCD 中起重要作用，其跨膜电位变化是早期 PCD 的标志之一。早期发生 PCD 的细胞中线粒体膜的通透性增加，引发促凋亡蛋白的释放，从而导致线粒体膜电位下降，最终出现线粒体肿胀、破裂，细胞核浓缩、染色质凝聚等现象［37，38］。目前主要采用 JC-1、罗丹明123、四甲基罗丹明乙酯（tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）等荧光探针检测线粒体膜电位的变化。Díaz-Tielas 等［39］利用 JC-1 检测查耳酮诱导的拟南芥根尖细胞 PCD 时发现，早期 PCD 细胞线粒体出现绿色荧光，正常细胞线粒体呈红色荧光。通过观察线粒体染色变化可检测到线粒体膜电位的下降，为早期 PCD 的研究提供依据。该方法简便、快捷，但不能辨别是否由于PCD 导致的线粒体膜电位变化，因此只能作为植物PCD 检测的补充方法。

3.3 细胞色素C 蛋白释放的检测

细胞色素C 蛋白（cytochrome C，Cyt C）作为线粒体呼吸链的基本成分之一，是线粒体启动 PCD程序的关键物质。由于Cyt C 不能透过线粒体，因此不能在细胞质中被检测到。植物细胞在物理、化学、生物等 PCD 诱导因子的作用下，线粒体膜通透性增加，引发 Cyt C 释放到胞质中，最终导致 PCD。在盐胁迫诱导的烟草细胞［40］以及铝诱导的花生根尖细胞 PCD［41］中都能检测到 Cyt C，此外利用 Cyt C处理胡萝卜原生质体可诱发PCD的产生［42］。

3.4 特异性基因检测

PCD 是一种受基因调控、主动的细胞死亡方式。目前，已从植物中筛选出了 CsCysP、 AtMYB30、mlo 等 PCD 相关基因。马岩岩等［43］发现 CsCysP基因在柑橘老叶、成熟的花瓣和脱落果萼离层等 PCD细胞中表达量较高，而在幼苗的根、茎、叶表达量低。Vailleau 等［44］发现 AtMYB30基因在拟南芥中的过量表达可加速和增强植物对病原菌的抗性，并诱导 PCD 以抵抗病原菌的入侵。此外，植物细胞中存在与动物细胞类似的一些 PCD 抑制基因，如 DAD、BI-1和CED 基因等，可根据这些基因的表达强弱来判断植物PCD被抑制的程度。Wang 等［45］发现TaDAD2 基因在条锈病菌（P. striiformis）诱导后的小麦中表达量下降，从而诱导 PCD 的产生和增强植株抗性。相反， TADAD2 基因的过量表达会抑制 PCD的产生，使植株易感病。

4 展望

植物细胞程序性死亡在生物体进化、内环境稳定等方面发挥重要作用，已成为生命科学的研究热点之一。目前已建立了多种植物 PCD 的检测技术，但各自均有优缺点，应充分了解各种检测方法的原理及应用范围，根据实际情况选用适宜的检测技术。植物 PCD 主要通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、电子显微镜进行形态学检测，或通过 TUNEL 法、琼脂糖电泳法等检测染色质 DNA 断裂。但形态学检测法耗时较长，费用昂贵，灵敏度低，且不易于 PCD的产生、机理等方面研究。TUNEL 法灵敏性高，能够检测各个时期的 PCD 细胞，但容易出现假阳性且背景值较高。琼脂糖电泳法只能检测晚期 PCD 细胞，且不能区分早期 PCD 细胞与坏死细胞。目前随着 PCD 在细胞生物学、发育生物学、分子生物学领域研究的深入，磷脂酰丝氨酸外翻检测法［46］、凋亡相关 mRNA 及 miRNA 的分析与检测［47］、分子探针法、 GFP 共表达重组型基因的检测与表达［48］及体内核磁共振检测法［49］等新兴检测技术逐渐应用于动物以及人类 PCD 领域的研究，并已获得成功。今后这些技术将有望在植物 PCD 研究中发挥重要作用。

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（责任编辑 狄艳红）

Progress on Detection Technology of Programmed Cell Death in Plant

DENG Yu-qing1LI Ping1ZHOU Yan1XIONG Ke-cai2LI Zhong-an1
（1. Citrus Research Institute, SouthWest University，Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712；2. Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, College of Plant Protection / SouthWest University，Chongqing 400716）

Programmed cell death (PCD) is an active response in cell biology, which widely exists in plant growth and development. It has become a hot research for life science in recent years. In this paper, progress in the detection of PCD by morphology, biochemistry and molecular biology were reviewed. Furthermore, the disadvantages for the existing detection methods of PCD were also discussed in order to lay a sound foundation for better study and use.

programmed cell death；apoptosis；tection technology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.008

2016-06-17

重庆市基础与前沿研究计划重点项目（ CSTC2015JCYJBX0043），中央高校基本科研业务费专项资金（XDJK2015A009，XDJK2016E047）

邓雨青，女，硕士研究生，研究方向：植物病理学；E-mail：dengyuqing828@163.com

李中安，男，研究员，研究方向：分子植物病理学、细胞生物学；E-mail：zhongan@cric.cn