叶类药材淫羊藿精准煮散饮片的质量研究＊

张 靖，徐 文，宫 璐，李西文，肖水明，徐 江，丘小惠＊＊，黄志海＊＊

（1. 广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院/中国中医科学院广东分院 广州 510006；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

叶类药材淫羊藿精准煮散饮片的质量研究＊

张 靖1，徐 文1，宫 璐1，李西文2，肖水明2，徐 江2，丘小惠1＊＊，黄志海1＊＊

（1. 广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院/中国中医科学院广东分院 广州 510006；2. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

目的：采用化学指纹图谱法结合DNA分子鉴定技术，考察淫羊藿精准煮散饮片与市售原饮片质量差异。方法：制备不同规格淫羊藿煮散饮片，对比市售饮片及煮散饮片的干膏收率；应用ITS2及psbA-trnH条形码序列对淫羊藿饮片进行分子鉴定；采用HPLC-DAD法进行3批次饮片混合粉碎前后质量均一性、指纹图谱及相似度评价。结果：淫羊藿煮散饮片出膏率略高于市售饮片；3批市售饮片指标成分淫羊藿苷提取率有明显的差异性，RSD为15.56%，煮散饮片差异较小RSD为6.82%。指纹图谱相似度评价结果显示，淫羊藿精准煮散饮片的指纹图谱相似度提高，标定共有峰10个，峰面积均有提高。ITS2及psbA-trnH序列对淫羊藿煮散饮片可实现准确鉴定。结论：淫羊藿精准煮散饮片与市售饮片基本属性相一致，但煮散饮片的浸膏提取率、指标成分的批间均一性有不同程度提升。研究结果显示发展精准煮散饮片有良好的应用前景。

淫羊藿 精准煮散饮片 DNA条形码 指纹图谱

中药煮散是传统中药的药用形式。先秦至唐宋时期盛行的中药煮散，将中药材粉碎成粗颗粒或粗粉，以水煎煮，去渣取汁或连同药渣服用。煮散的粉碎过程破坏了药材形态，导致“辨药之难”，后逐步被具有药物鉴别特征的中药饮片所取代[1，2]。随着现代中药DNA条形码鉴定体系及其二维码技术的推广与应用，并且结合中药指纹图谱技术[3-6]，中药质量控制体系逐步精准化，可提供精准的中药识别溯源与检测，能有效解决传统煮散的“辨药之难”。由此本课题组提出“精准煮散饮片”的概念与思路[7]，将中药饮片的形状规格微小化、均匀化处理，可使饮片批量规模稳定化，批内质量均一化，提高临床汤剂用药的精准性。

淫羊藿是现行药典中规定来源物种最多的药材之一，来源于淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿E. sagittatum(Sieb. et Zucc) Maxim.、柔毛淫羊藿E. pubescensMaxim和朝鲜淫羊藿E. koreanumMaxim.等4个种的干燥叶，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用[8]。淫羊藿对心脑血管系统、血液系统、免疫系统、生殖系统和骨髓系统等均有一定的保健作用，具有增强免疫、镇静、抗抑郁、抑菌抗炎、抗病毒、抗肿瘤、保护心脑血管系统、调节内分泌、抗骨质疏松、抗氧化、抗衰老等多种生理活性[9-12]。淫羊藿中含有黄酮类化合物、多糖、生物碱、木脂素、萜类等多种结构类型的化合物，其中黄酮类化合物为其主要起效成分，总黄酮及淫羊藿苷为现行药典中淫羊藿的药材和相关制剂的质量控制成分[13-15]。

中国是世界淫羊藿物种的主要分布地，是国际淫羊藿药材与提取物的主要供应国。研究资料表明，淫羊藿属植物共有56种，其中中国分布48种和3个变种。淫羊藿生药材商品的植物来源复杂，在实际应用中有20多种淫羊藿用于临床实践[16]。很多种淫羊藿的药理活性成分含量很低，达不到《中国药典》要求[17]。淫羊藿药材质量可能受到物种或品种、产地或生境、采摘或收获时期、栽培技术等多种因素的影响，导致淫羊藿饮片质量不均一，直接影响临床用药疗效的稳定。根据本课题组提出的“精准煮散饮片”理论体系，本文将对淫羊藿煮散饮片进行研究，以饮片规格、含量均匀度、指纹图谱与相似度评价、DNA序列比对为考查重点，对淫羊藿精准煮散饮片的质量开展系统评价，以期揭示精准煮散饮片应用的优势，实现中药饮片的质量均一化。

1 材料与仪器

图1 淫羊藿原饮片及煮散饮片形态

色谱甲醇、乙腈为德国默克公司生产，其他试剂为分析纯，煎煮用水为蒸馏水、液相用水为millipore制备纯水。淫羊藿苷对照品购于成都曼斯特生物科技有限公司（批号：MUST-16101705）。3批淫羊藿饮片分别购置于康美药业（批号：160404531、160900951）和广州至信药业股份有限公司（批号：160202），产地依次为：甘肃、甘肃、江苏。其他试剂为DP305植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号：P4104）；Tris（美国Sigma公司，批号：V900483）；β-巯基乙醇（美国Sigma公司，批号：M6250）；DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司，批号：P4219）；Tris-HCl（上海麦克林生化科技有限公司，批号：T818979）；琼脂（美国Sigma公司，批号：V900500）；Glodview（上海赛百盛基因技术有限公司，批号：20151209）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成；2×Tap PCR Mix酶（北京艾德莱生物科技有限公司，批号：262451AX）。

美国Agilent 1260型高效液相色谱仪（四元泵，自动进样器及DAD检测器），BT 125 D型十万分之一分析天平（瑞士Mettler-toledo公司，型号：BT 125 D）、万分之一分析天平（德国Sartorius公司，型号：BS 224 S）、HTP-312电子天平（上海花潮电器有限公司）、DK-S26电热水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）、Centrifuge 5430R高速台式冷冻离心机（德国eppendorf公司），RT-35粉碎机（台中市荣聪精密科技有限公司）、ProFlex型PCR仪（美国Life Technologies公司，型号：ProFlex）、Mini-Sub Cell GT型水平电泳槽（美国Bio-Rad公司，型号：Mini-Sub Cell GT）、GelDoc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司，型号：GelDoc XR+）、NanoDrop 2000c型分光光度计（美国Thermo Scientific公司，型号：NanoDrop 2000c）。

2 实验方法

2.1 不同规格饮片出膏率比较研究

取市售淫羊藿饮片（批号：160404531）经粉碎均匀，过筛，分别得5-10目（2-4 mm）、10-24目（0.8-2.0 mm）、24-65目（0.25-0.80 mm）3种规格的煮散饮片。称取上述煮散饮片各100 g，采用标准汤剂的方法[18]进行煎煮。分别加12倍量水，先浸泡30 min，煮沸30 min，过滤分离出煎煮液，再加10倍量水煎煮30 min。合并煎煮液，浓缩成100 mL溶液，即为1 g·mL-1的药材提取溶液。精密吸取25 mL于蒸发皿中，60℃真空干燥至恒重，称量重量，根据出膏率公式计算出膏率。

2.2 原饮片与煮散饮片均一性比较

分别取3个批次市售饮片各200 g，充分混合后，粉碎均匀，过筛，得到10-65目粒径范围的煮散饮片，取其中300 g，均匀摊平，画格分为9份，随机选取3份（S1-S3），从每份中分别称取20 g；另分别取同批次原饮片各取20 g（S4：160404531，S5：160900951，S6：160202），上述6份样品按2.1项下方法煎煮。合并煎煮液，浓缩成100 mL溶液，即浓缩为0.2 g·mL-1的原药材溶液。原饮片及煮散饮片形态见图1。

2.3 高效液相测定方法

2.3.1 对照品溶液制备

精密称取淫羊藿苷对照品适量，加入甲醇配制成每1 mL含0.1 mg淫羊藿苷的对照品溶液，过0.22 μL微孔滤膜，备用。

2.3.2 样品溶液制备

取上述饮片提取浓缩液2.5-10.0 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即得供试品溶液，进样前用0.22 μm滤膜过滤。

2.3.3 含量测定方法

采用高效液相方法测定，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。检测方法按照《中国药典》2015年版一部淫羊藿含量测定项下淫羊藿苷测定方法。

2.3.4 指纹图谱测定方法

采用高效液相方法测定，流动相由乙腈（A）和水（B）组成，洗脱梯度如下表；检测波长为270 nm，流速为1 mL·min-1，进样量为20 μL（表1）。

2.4 DNA条形码检测方法

选取各批次及混合后煮散饮片样本各约40 mg，用组织研磨仪磨碎，采用植物DNA提取试剂盒提取基因组总DNA。PCR扩增步骤与文献一致，分别扩增ITS2及psbA-trnH序列[5]。PCR扩增产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将电泳条带清晰、明亮、单一的PCR产物送测序公司进行双向测序。序列校对拼接采用CodonCode Alinger 6.02，去除低质量区并采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8S和28S区段，获得完整的ITS2序列。利用软件MEGA 6.06分析比对，分析ITS2序列特点。

3 结果

3.1 不同规格饮片出膏率考察

不同规格煮散饮片与市售原饮片的煎煮出膏率结果如表2所示，与原饮片比较，粉碎后不同粒径煮散饮片的出膏率均有一定程度增加；但不同规格煮散饮片之间的出膏率差异不明显。在煎煮过程中发现，如果饮片粉碎过细（小于65目），容易在煎煮过程中产生糊化现象。

表1 指纹图谱测流动相洗脱梯度

表2 市售原饮片与不同粉碎度精准煮散饮片的出膏率（±s，n=3）

表2 市售原饮片与不同粉碎度精准煮散饮片的出膏率（±s，n=3）

饮片规格出膏率/%澄清度原饮片11.96±0.14 ++++ 5-10目（2-4 mm）14.85±0.52 +++ 10-24目（0.8-2.0 mm）13.02±1.76 +++ 24-65目（0.25-0.80 mm）16.46±0.18 ++

图2 淫羊藿苷对照品HPLC-DAD色谱图

图3 淫羊藿饮片HPLC-DAD色谱图

3.2 饮片指标成分含量均一度评价

实验以淫羊藿主要指标成淫羊藿苷（药典含测指标）为检测指标，对3批淫羊藿饮片及其经混匀粉碎后的煮散饮片进行均一性比较，对照品及样品溶液HPLC-DAD色谱图分别见图2、图3。

表3 淫羊藿饮片绿原酸煎煮提取率结果

表4 淫羊藿270 nm指纹图谱相似度结果

采用《中国药典》含量测定方法，对6份淫羊藿样品进行测定，各饮片的淫羊藿苷含量测定结果如表3所示。结果表明，淫羊藿3批市售饮片经均一化处理后，指标性成分淫羊藿苷含量的RSD值显著下降，说明3批样品经粉碎处理后均一度得到明显提高。

3.3 指纹图谱研究

3.3.1 指纹图谱及相似度评价

取上述药材，按指纹图谱检测方法检测，检测波长为270 nm的淫羊藿煎煮液主要色谱峰指纹图谱如图4所示。采用国家药典委员会2014年版指纹图谱相似度评价软件，比较市售原饮片与煮散饮片指纹图谱相似度，见表4。结果显示在现有的检测方法下，市售饮片与经粉碎混匀得淫羊藿煮散饮片共6批样品的主要色谱峰均可以良好的匹配，相似度分析结果显示粉碎后样品（S1-S3）的相似度均在0.90以上，而3批原饮片由于产地来源等因素影响，产于江苏的样品S6其相似度为0.85，另外2批相似度可达0.90以上。通过指纹图谱分析结果表明，样品经粉碎后其液相指纹图谱未发生明显改变，采用指纹图谱相识度分析方法可以用于淫羊藿煮散饮片的真伪鉴别。同时，不同批次样品经粉碎后，其相似度得到提高，进一步说明淫羊藿煮散饮片经粉碎后其均一性得到提高。

图4 市售原饮片及混合后精准煮散饮片HPLC指纹图谱

3.3.2 共有峰相对峰面积比较

实验还比较了市售饮片与煮散饮片8个共有峰相对峰面积，如表5所示，结果表明经粉碎处理的淫羊藿煮散饮片（S1-S3）在共有峰的个数及峰面积方面，其均一性均比3批原饮片较高，进一步说明了样品经粉碎后均一性得到提高。

3.4 DNA条形码序列分析

应用MEGA6.06分析淫羊藿3条ITS2序列特征，发现种内无变异位点，3条淫羊藿序列长度均为247 bp，A、C、G、T的碱基含量分别为17.81%、28.74%、26.32%、27.13%，GC含量达55.06%。3条psbA-trnH序列比对后长度为499 bp，存在1个变异位点，为207位点G/T突变。经中药材DNA条形码鉴定系统鉴定为朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum。主导单倍型序列特征见图4、图5。

4 讨论

本文收集了3批次淫羊藿市售饮片，饮片均匀混合粉碎后制成煮散饮片，采用HPLC-DAD含量测定法、指纹图谱分析法以及DNA序列比对研究等研究方法，比较淫羊藿煮散饮片与市售饮片质量差异。研究结果表明，原饮片与精准煮散因在成分的种类上未有明显改变，具有属性的一致性，但粉碎混匀后的精准煮散饮片指纹图谱相似度更好，其浸出率及质量均一性有所提高。

表5 共有峰峰面积比较

图5 淫羊藿ITS2序列

图6 淫羊藿psbA-trnH序列

淫羊藿为叶类饮片，质脆易碎，较轻薄、疏松，并含有部分木质纤维，破碎时易出现少量纤维与细颗粒分离，一定程度上影响饮片的质量均一性，所以淫羊藿破碎推荐采用剪切式粉碎仪，将淫羊藿药材切割成大小较均一的片状细微颗粒。精准煮散饮片仅是改变了中药饮片的形状规格，使其微小均匀化，与传统中药煮散并无不同，但其内涵超越了传统中药煮散，可实现饮片质量均一化，饮片分装、调剂、煎煮自动化，使中药剂量和汤剂质量更加精准，并能提高中药资源的合理利用。此外，叶类药材品种之间整体状的表现差异较小，极易混淆，影响用药安全。中药DNA条形码鉴定体系与中药指纹图谱技术的发展，解决了叶类药材及传统煮散的“辨药之难”问题，能有效实现煮散饮片的精准化鉴定和检测，为精准煮散饮片的应用与推广提供可靠的技术支持与保障。

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A Quality Research on the Precise Powder Decoction Pieces of Medicinal Leafage Epimedii Folium

Zhang Jing1, Xu Wen1, Gong Lu1, Li Xiwen2, Xiao Shuiming2, Xu Jiang2, Qiu Xiaohui1, Huang Zhihai1
(1. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine / Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences / China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch, Guangzhou 510006, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed at evaluating the quality of precise powder decoction pieces (PPDP) ofE. Folium(EF) compared with the traditional commercial slices by chemical fingerprint methods and DNA molecular identification technology. Different specifications of PPDP were prepared， and their dry extract contents were incontrast with that of commercial slices. The slices of EF were identified using ITS2 and psbA-trnH sequences. Three batches of commercial slices were collected， and the content uniformity， fingerprint and similarity evaluation before and after the mixing and pulverization were detected by HPLC-DAD and DNA sequence alignment. It was found that the paste rate of PPDP was slightly higher than that of the traditional commercial slices. The dissolution of chlorogenic acid of PPDP was higher than that of the traditional commercial slices. RSD of inter-assay dissolutions of chlorogenic acid of commercial slices was 15.56%， which was reduced to 6.82% after mixing and preparing into PPDP. The fingerprints showed that the similarity of the PPDP of EF was elevated with the inceases of 10 marketed common peaks. The PPDP of EF was accurately identified by ITS2 and psbA-trnH sequences. In conclusion， compared with traditional commercial slices of EF， the PPDP apparently improved the dissolution rate and the quality uniformity， demonstrated that the boiled powder of CRP achieved obvious clinic advantages.

Epimedii Folium， precise powder decoction pieces， DNA barcode， fingerprint

10.11842/wst.2017.01.015

R28

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-12-23

修回日期：2017-01-04

＊ 广东省中医院院内专项（2015KT1817）：岭南中草药DNA条形码分子鉴定和生态适应性研究，负责人：黄志海；中国中医科学院中医药健康服务发展专项（ZZ0908067）：200余种岭南中草药DNA条形码研究，负责人：黄志海。

＊＊ 通讯作者：丘小惠，研究员，主要研究方向：中药物质基础研究；黄志海，主任药师，主要研究方向：中药资源与中药鉴定研究。