鸡血藤精准煮散饮片与原饮片质量的对比性研究＊

徐 文，雷 迪，张 靖，徐 江，黄志海，丘小惠，Julie A.Hawkins＊＊＊，陈士林＊＊＊

（1. 广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院/中国中医科学院广东分院 广州 510006；2. 雷丁大学生物科学学院 英国 RG6 6AH；3. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

鸡血藤精准煮散饮片与原饮片质量的对比性研究＊

徐 文1＊＊，雷 迪2，张 靖1，徐 江3，黄志海1，丘小惠1，Julie A.Hawkins2＊＊＊，陈士林3＊＊＊

（1. 广州中医药大学第二附属医院/广东省中医药科学院/中国中医科学院广东分院 广州 510006；2. 雷丁大学生物科学学院 英国 RG6 6AH；3. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）

目的：本研究采用化学指纹图谱法及DNA条形码分子鉴定技术对鸡血藤饮片煮散质量体系进行探索研究。方法：应用ITS2序列作为DNA条形码对鸡血藤进行鉴定，对比鸡血藤原饮片及精准煮散饮片的出膏率；收集3个批次鸡血藤饮片，采用HPLC法进行3批次饮片混合粉碎前后质量均一性、指纹图谱与相似度评价。结果：ITS2序列对鸡血藤药材可实现准确鉴定。鸡血藤煮散饮片出膏率及指标成分表儿茶素含量均略高于原饮片；原饮片批间表儿茶素溶出量有明显差异性RSD为11.0%，混合后制成煮散饮片后差异性明显降低RSD为1.0%。指纹图谱中14个共有峰相对峰面积均有所提高，RSD值明显减少。结论：鸡血藤精准煮散饮片提高原饮片的浸出率，成分溶出率及质量均一性，表明鸡血藤煮散饮片有较好的的临床应用优势。

精准煮散饮片 鸡血藤 均一性 DNA条形码 质量体系

鸡血藤为豆科植物密花豆Spatholobus suberectusDunn.的干燥藤茎，具有补血、活血、通络的功效，用于治疗月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症，主产于广西、广东，以野生药材入药[1]。鸡血藤中主要含黄酮类、有机酸、蒽醌类、甾体及三萜类等化学成分[2，3]。由于近年来的过度砍伐与利用，其野生资源蕴藏量不断下降，一些比较细的或达不到入药要求的藤茎亦被采挖和药用，因而鸡血藤药材的质量参次不齐，其化学成分含量差异非常大[4-6]，直接影响临床用药疗效及稳定性。因此需要一种易于鉴定和检测，可经标准化工艺制备、规模化生产、质量均一的方法，以提高临床用药疗效稳定的新型饮片。

本课题组前期研究提出的“精准煮散饮片”理论体系[7]，其实质是通过标准化和规范化工艺将中药饮片的形状规格微小化、均匀化处理，使饮片批量规模稳定化，批内质量均一化，实现了准确、高效的自动化分装、调剂、煎煮流程，提高临床汤剂用药的稳定有效。中药煮散起源于先秦，盛行于唐宋，是将中药粉碎成一定粒度与水共煎，去渣取汁制成的中药液体制剂。通过将药材粉碎，制成煮散，有利于提高药材煎煮效率，减少药材使用量，具有省材、省时之特点[8-10]。煮散的缺点在于粉碎过程中破坏药材形态，丧失药物鉴别特征，导致“辨药之难”，逐步被中药饮片所取代[11，12]。近年来，随着中药DNA条形码鉴定体系及中药指纹图谱技术的应用与发展为构成精准化的中药质量控制体系，提供精准化的中药识别溯源与检测，实现药品基源、生产加工及市场流通等多领域监管，有效解决传统煮散的“辨药之难”问题。本研究以鸡血藤为考察对象，以饮片规格、含量、指纹图谱与相似度评价及DNA条形码比对为考查重点，以期揭示精准煮散饮片应用的优势，实现中药饮片的质量均一化，使之实现生产和配给的标准化、自动化，为中医临床疗效提供可靠保障。

1 实验材料

1.1 主要仪器及试剂

美国Waters2695型高效液相色谱仪系统（Empower 色谱工作站， W2998 DAD检测器）；BT125D十万分之一分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）；粉碎机（台湾荣聪铁工厂）；2720 Thermal Cycler PCR仪（美国 Applied Biosystems公司）；DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；JY04S-3C型凝胶成像分析系统（北京君意东方电泳设备有限公司）；1-14 小型离心机（德国Sigma公司）；MX-RL-E型混合仪（大龙兴创仪器有限公司）；DP305植物组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；Glodview（上海赛百盛基因技术有限公司）；Tris-HCl（上海麦克林生化科技有限公司，生产批号：T818979）；Tris（美国Sigma公司，生产批号：V900483）；β-巯基乙醇（美国Sigma公司，生产批号：M6250）；琼脂（美国Sigma公司，生产批号：V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，2×Tap PCR Mix酶（北京艾德莱生物科技有限公司）；乙腈、甲酸均为色谱纯（美国Fisher公司）；超纯水由Millipore制得。

1.2 受试药物

表儿茶素（含量≥98%，生产批号：110878-200102），购于中国药品生物制品鉴定所；鸡血藤市售饮片分别购自康美药业有限公司（产地：广西，生产批号：160811031、160301031）及岭南中药饮片有限公司（产地：广西，生产批号：160302），经本实验室黄志海主任中药师鉴定均为2015版《中国药典》（一部）鸡血藤项下收载品种。

2 实验方法

2.1 DNA 条形码的建立

取饮片样本约40 mg，用液氮进一步磨碎，采用植物DNA提取试剂盒提取基因组总DNA。ITS2序列扩增采用正向引物ITS2F： 5′-ATGCGATACTTGGTG TG AAT-3′，反向引物：ITS3R： 5′-GACGCTTC TCCAGACTACAAT-3′，进行扩增。PCR反应体系为25 μL，包括2×Taq PCR Mix 酶12.5 μL，正向、反向引物各1 μL（2.5 μmol·L-1），模板DNA 2.0 μL（约30-100 ng），加ddH2O补足至25 μL。扩增程序：94℃变性5 min；94℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（40个循环）；72 ℃延伸10 min[10]。PCR扩增产物采用1.2 %琼脂糖凝胶电泳进行检测，将电泳条带清晰、明亮、单一的PCR产物送测序公司进行双向测序。

2.2 指纹图谱检测方法

2.2.1 色谱条件的建立

色谱柱：Welch ODS-3 C18（4.6×250 mm，5 μm）；柱温：25℃；流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（5%→20%）；流速：1 mL·min-1，检测波长：286 nm；柱温：25℃；洗脱时间：28 min；进样体积：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取表儿茶素对照品适量，加甲醇配制成含表儿茶素1 mg·mL-1的对照品溶液，表儿茶素对照溶液依次稀释成80、40、20、10、5及2.5 μg·mL-1系列标准品溶液，置于4℃冰箱中保存，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密量取适量饮片提取液，用水稀释成相当于鸡血藤饮片0.02 g·mL-1的供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察

按照2.2.1项下色谱条件进样分析。以对照品峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，计算回归方程，考察表儿茶素在上述色谱条件下的线性关系。

2.3 原饮片与煮散饮片出膏率比较

不同规格鸡血藤煮散饮片制备：取鸡血藤饮片（生产批号：160301301），粉碎后过筛，得到5-10目（2-4 mm）、10-24目（0.8-2 mm）、24-65目（0.25-0.8 mm）等不同粒径范围的煮散饮片。

称取原饮片及不同粒径范围煮散饮片各100 g，采用标准汤剂煎煮法[13]进行提取。分别加8倍量水，浸泡30 min，煮沸后保持30 min，过滤，滤渣再加7倍量水煎煮30 min。合并过滤液，减压旋蒸至100 mL，即浓缩为相当于鸡血藤饮片1 g·mL-1的药液。精密量取25 mL溶液，蒸干，得干浸膏重量，计算出膏率。

2.4 原饮片与煮散饮片均一性比较

分别取3个批次鸡血藤饮片各200 g，充分混合后，粉碎，过筛，取10-65目粒径范围的煮散饮片。原饮片及精准煮散饮片形态见图1。不同批次原饮片各取50 g（S1的批号为160811031，S2的批号为160301031，S3的批号为160302）；取10-65目鸡血藤煮散饮片，均匀摊平，画格分为9份，随机选取3份（S4-S6），从每份中分别称取50 g。

上述6份样品分别按标准汤剂煎煮法进行提取。合并煎煮液，浓缩成100 mL溶液，即浓缩为0.2 g·mL-1的原药材溶液。合并提取液，定容至500 mL，即为相当于鸡血藤饮片0.1 g·mL-1的药液。精密量取药液并用水稀释5倍，采用0.22 μm滤膜过滤，取10 μL进样。

2.5 数据处理

所得序列采用CodonCode Alinger 6.02软件进行校对拼接，去除序列两端低质量区。利用软件MEGA 6.06对不同样本序列进行比对，分析ITS2序列特点。以条形码附加二维码的方式展示主导单倍型序列特征，左侧部分为DNA序列转换的彩色条形码图片，右侧二维码图片为QRcode的编码方式进行编码，扫描可读取序列信息（图2）。

采用SPSS17.0软件进行数据分析，两两比较时，采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

HPLC图谱采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004 A版），生成指纹图谱共有模式，计算样品的相似度。标定共有峰，以表儿茶素为参照峰，计算共有峰的相对保留时间与相对峰面积。

3 实验结果

3.1 ITS2序列分析

应用MEGA6.06分析鸡血藤3条ITS2序列特征，发现种内存在2个变异位点，分别为22位点的G/A突变和83位点的C/T突变，3条鸡血藤序列长度均为207 bp。A、C、G、T的碱基平均含量分别为12.80%、34.54%、35.51%、17.15%，GC含量达70.53%，主导单倍型序列见图2。BLAST搜索结果显示各样品相似性最高的为密花豆Spatholobus suberectus与其最相似序列的相似度为100%，表明ITS2序列对鸡血藤药材可实现准确鉴定。

图1 鸡血藤饮片形态图

图2 鸡血藤ITS2条形码

表1 鸡血藤原饮片与精准煮散饮片出膏率（±s，n=3）

表1 鸡血藤原饮片与精准煮散饮片出膏率（±s，n=3）

注：“+++”：澄清度较高，”++”：较为澄清；“-”：未见明显糊化。

饮片规格出膏率/%澄清度糊化度原饮片14.01±0.25 +++ -5-10目（2-4 mm）15.53±0.12 +++ -10-24目（0.8-2 mm）15.67±0.15 ++ -24-65目（0.25-0.8 mm）14.63±0.15 ++ -

图3 表儿茶素对照品（A）、鸡血藤水提液（B）HPLC色谱图；

表2 原饮片与精准煮散饮片提取液中表儿茶素含量（±s，n=3）

表2 原饮片与精准煮散饮片提取液中表儿茶素含量（±s，n=3）

组别编号含量/ mg·g-1x±sRSD/% S1 1.10原饮片提取液S2 1.00 S3 0.89 1.00±0.11 10.54 S4 1.27煮散饮片提取液S5 1.26 S6 1.28 1.27±0.00 0.78

表3 鸡血藤指纹图谱相似度结果

3.2 原饮片与煮散饮片出膏率比较

出膏率考察结果表明，与原饮片比较，粉碎后不同粒径煮散饮片的出膏率均较原饮片有所提高，不同粒径煮散饮片间出膏率无显著性差异（表1）。

3.3 色谱条件考察

将对照品溶液及供试品溶液按“2.2.1”项下色谱条件进行进样，发现该色谱条件下表儿茶素分离度良好，对照品及提取液色谱图见图3。以对照品峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，回归方程为：表儿茶素（286 nm），Y=2774X-2403（R2=0.999 9），表明表儿茶素在2.5-80 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

3.4 饮片均一性评价

以表儿茶素为考察指标，测定其在原饮片及煮散饮片中的含量，实验结果见表2。结果显示，混合制成煮散饮片后指标成分煎出率有所提高；而其含量均值的RSD值明显减小，表明饮片质量及均一性有所提高。

3.5 指纹图谱研究

3.5.1 指纹图谱及相似度评价

按照“2.2.1”项下方法，对鸡血藤饮片水提液进行指纹图谱的测定，实验结果见图4。以鸡血藤原饮片为参照谱，进行自动匹配并计算指纹图谱相似度，计算结果见表3。结果显示，在现有的检测方法下，原饮片与经粉碎混匀得鸡血藤煮散饮片样品共6批样品的主要色谱峰均可以良好的匹配，相似度分析结果显示原饮片的相似度在0.912-1.000之间，而煮散饮片的相似度均在0.977以上，表明鸡血藤精准煮散饮片均一性明显提高。

3.5.2 指纹图谱共有峰的标定

本研究中以原饮片中表儿茶素（tR=40.765 min）为参考峰，计算制得精准煮散饮片与原饮片各共有峰的相对峰面积（表4）。结果表明，鸡血藤煮散饮片14个共有峰相对峰面积略高于原饮片，均一性明显提高。

4 讨论

图4 鸡血藤原饮片及精准煮散饮片HPLC指纹图谱

鸡血藤具有活血补血、调经止疼、舒筋活络的功效，用于治疗月经不调、痛经、经闭、风湿痹痛、麻木瘫痪、血虚萎黄等症。《中国药典》对鸡血藤饮片性状描述为椭圆形、长矩圆形或不规则的斜切片，厚3-10 mm。鸡血藤煮散饮片为颗粒型饮片，在10-65目之间，药液过滤速度适度，澄清度尚可；与原饮片比较，粉碎后不同粒径煮散饮片的出膏率均有增加；但不同粒径差异不明显。比较鸡血藤煮散饮片与原饮片指纹图谱，其共有峰的平均溶出均略有升高，但均一性改善明显，混合粉碎后的精准煮散饮片指纹图谱相似度更佳。

鸡血藤为藤茎类饮片，含有大量的木质纤维，破碎时容易出现纤维素与细粉分离，反而导致精准煮散饮片含量降低，浸膏提取率降低的现象，所以鸡血藤破碎需用剪切式粉碎仪，将鸡血藤切割成大小均一的颗粒状饮片即可。

中药HPLC指纹图谱结合DNA条形码技术保证鸡血藤物种的正确性及质量的可靠性。解决了传统煮散的“辨药之难”问题，能有效实现煮散饮片的精准化鉴定和检测，为精准煮散饮片的应用与推广提供可靠的技术支持与保障。同时，发展精准煮散饮片能提高中药药效物质的溶出和保证汤剂煎煮质量的稳定，从而在保证疗效的前提下，可降低药物使用量，节约资源，提高中药资源的合理利用，降低药品费用。

表4 鸡血藤共有峰相对峰面积比较

参考文献

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13 陈士林,刘安,李琦,等. 中药饮片标准汤剂研究策略. 中国中药杂志,2016,40(8)：1367-1375.

A Quality Comparison Between the Precise Powder Decoction Pieces and the Original Slices of Spatholobus suberectus Dunn.

Xu Wen1, Lei Di2, Zhang Jing1, Xu Jiang1, Huang Zhihai1, Qiu Xiaohui1, Julie A. Hawkins2, Chen Shilin3
(1. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine / Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences / China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch, Guangzhou 510006, China; 2. School of Biological Science, University of Reading, Berkshire RG6 6AH, United Kingdom; 3. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

In this study， DNA molecular identification technology and chemical fingerprint method were adopted to evaluate the quality system of precise powder decoction pieces (PPDP) ofS. suberectusdunn (SSD). ITS2 sequence was taken as DNA barcode to indentify SSD. Different specifications of PPDP were prepared， their dry extract contents were quantified in contrast with that of original slices. Three batches of SSD original slices were gleaned and the content uniformity， fingerprint and similarity evaluation before and after the mixing and pulverization were valued by HPLC-DAD. As a result， ITS2 successfully and accurately identified the SSD in this study. The extract rate of PPDP was 15.5%， 1.11 times as much as the original slices. RSD of inter-assay dissolution of cepicatechin from the original slices was 11.0%， which was reduced to 1.0% after mixing and preparing into PPDP. The relative peak area of the 14 common peaks identified by fingerpringts were larger， while the RSD values significantly decreased. It was concluded that the PPDP of SSD improved the extraction efficiency and uniformity of the original slices， featuring quite prospective in more reasonable and scientific clinical use.

Precise powder decoction pieces，Spatholobus suberectusdunn， uniformity， DNA barcode， quality system

10.11842/wst.2017.01.012

R283.3

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-12-23

修回日期：2016-12-23

＊ 广东省中医院专项（2015KT1817）：岭南中草药DNA条形码分子鉴定和生态适宜性研究，负责人：黄志海；中国中医科学院中医药健康服务专项（ZZ0908067）：200种岭南中草药DNA条形码研究，负责人：黄志海。

＊＊ 徐文、雷迪为共同第一作者。

＊＊＊ 通讯作者：Julie A.Hawkins，主要研究方向：植物分子生物学；陈士林，本刊执行主编，博士，研究员，主要研究方向：生药分子鉴定研究。