脂肪间充质干细胞对肾缺血再灌注损伤的保护作用

黄克静 黄婷 胡文兵 向丽娜

·实验研究·

脂肪间充质干细胞对肾缺血再灌注损伤的保护作用

黄克静 黄婷 胡文兵 向丽娜

目的 观察自体脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)对缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)所致的急性肾损伤的保护及修复作用。方法 将成年雄性SD大鼠24只随机分为3组：对照组，模型组，治疗组，每组8只。大鼠在IR建模前14 d，取其大网膜周围的脂肪组织制备自体ADMSCs，并在建模前1 d测定大鼠的血肌酐、尿量及尿白蛋白/肌酐比值作为对照。模型组和治疗组制备缺血再灌注肾损伤模型，对照组只打开腹腔。建模1 h后，将自体ADMSCs经大鼠尾静脉移植到治疗组，对照组和模型组给予同等体积的生理盐水。细胞移植24 h、72 h后取大鼠血清和尿液检测血肌酐、尿量及尿白蛋白/肌酐比值；在72 h后取肾脏组织通过HE染色进行病理组织学观察；免疫印迹(Western blot)法检测肾脏组织内血红素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)及磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶1(NAPDH quinineoxidoreductase-1，NQO-1)的相对表达水平。结果 治疗组血清肌酐水平和尿白蛋白/肌酐比值较模型组明显减轻(P<0.05)；病理组织学观察显示，模型组大鼠肾脏肾小管存在形态学损伤，而治疗组大鼠肾脏病理损伤明显轻于模型组；Western blot分析显示治疗组抗氧化标志物NQO-1和HO-1的蛋白表达水平显著高于模型组(P<0.05)。结论 ADMSCs经大鼠尾静脉移植后，对IR所致的肾损伤具有明显的修复作用，其修复肾脏损伤机制可能与抗氧化应激有关。

肾缺血再灌注损伤；脂肪间充质干细胞；大鼠；血红素氧化酶1

肾缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤在临床上常见于急诊休克复苏、肾脏手术及肾脏移植等过程中，是影响肾功能的一个重要因素[1-3]。IR损伤的表现包括急性肾小管上皮细胞损伤，肾小管外周微血管的损伤以及炎症反应和白细胞浸润。实验研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治疗缺血相关的器官功能障碍是有效的[4-6]，但是MSCs改善肾功能的确切机制仍不清楚。本实验拟通过研究自体脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)移植对大鼠IR的保护作用，为临床治疗提供一定的实验依据和思路。

材料与方法

一、实验材料

1.动物模型 雄性SD大鼠共24只，体质量275～300 g，在分离ADMSCs前随机分成3组：对照组、模型组、治疗组，每组8只。

2.主要试剂 L-DMEM、胎牛血清购自Hyclone公司，EDTA-Trypsin及流式细胞仪检测表面标记的所有抗体购自Sigma公司。

二、方法

1.ADMSCs的分离、培养与鉴定 在诱导IR损伤前14 d，将3组大鼠进行吸入异氟烷麻醉，小心切除大网膜周围脂肪组织0.5 g。随后将该组织切成小于1 mm3的碎块，按3∶1(生理盐水∶脂肪组织)的比例往匀浆脂肪组织中加入37 ℃无菌生理盐水，接着加入备用的胶原酶溶液至终浓度为0.5 U/ml。将含该反应体系的离心管放置37 ℃水浴箱60 min，期间取出振动4次。消化后，常温下离心5 min，弃上清，生理盐水洗2次，将所有的细胞放入含有10%胎牛血清的培养基培养14 d，每只大鼠可以获得大约3×106ADMSCs。培养的细胞用流式细胞仪对细胞表面标志物进行分析鉴定。

2.制模及注射ADMSCs 术前12 h对大鼠禁食，水合氯醛(35 mg/kg)麻醉，异氟烷吸入麻醉并用，取腹部正中切口，逐层分离皮肤、皮下组织、腹膜，然后进入腹腔，找到肾蒂，用无创性动脉夹迅速夹闭双侧肾蒂，1 h后去掉动脉夹，让血流恢复灌注。对照组只进行剖腹。恢复灌注1 h后，模型组大鼠尾静脉注射35 μl低糖DMEM细胞培养基，治疗组大鼠注射同等体积的ADMSCs(1.0×106)。建模后72 h将动物处死，收集肾脏用于后续研究。

3.肾功能测定 测定诱导IR之前及诱导IR后24 h、72 h 各组大鼠的血肌酐、尿白蛋白和尿肌酐水平。

4.HE染色和病理组织学评分 所有大鼠的肾脏标本固定在10%福尔马林缓冲液中，石蜡包埋，切片5 mm厚，HE染色。组织学检查采用盲法，对肾小管坏死的严重程度进行评分。随机选择10个视野，根据肾小管坏死、刷状缘减少、管型形成和肾小管扩张的程度评定分为以下等级：0(无)，1分(≤10%)，2分(11%～25%)，3分(26%～45%)，4分(46%～75%)，5分(>76%)。

5.Western Blot分析 取等量的肾脏蛋白提取物(100 μg)上样，10%SDS-PAGE分离。电泳后，分离的蛋白电泳转移到聚二氟乙烯(PVDF)膜上。把膜放置在封闭液(含5%脱脂牛奶和0.05% Tween 20的T-TBS)中孵育1 h，室温下膜和一抗(1∶1 000)孵育1 h，在辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)室温下和膜孵育1 h，洗涤3次，ECL反应检测信号。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件，数据以均数±标准差表示，多组间均数比较，方差齐者用一维方差分析，组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、诱导IR后血肌酐、尿量和尿白蛋白/肌酐比值的变化

选择IR建模后24 h、72 h测定血肌酐的变化，模型组(棕色柱状图)肌酐显著高于对照组(蓝色柱状图)和治疗组(黄色柱状图)，治疗组显著高于对照组(P<0.05)。这些结果表明在实验环境中成功诱导IR损伤，ADMSCs移植在IR急性期显著缓解IR引起的肾功能恶化。诱导IR后24 h，3组每日尿量没有差异，但诱导IR后72 h，治疗组的尿量与模型组相比显著增加。相反，在诱导IR后24 h和72 h，治疗组尿白蛋白/肌酐的比值低于模型组(P<0.05)。(图1)

二、肾组织病理学评分

IR所致肾损伤在组织学上表现为广泛的肾小管坏死和扩张以及管型形成和刷状缘减少(图 2)。

IR后72 h治疗组的肾损伤较模型组明显减轻(P<0.05)，表明ADMSCs治疗能显著改善IR诱导的肾脏损伤。

对照组、模型组、治疗组肾脏局部HE染色(200×in A，B&C；400×in D，E&F)结果显示，与其他组比较，模型组呈现高程度的肾小管刷状缘减少，管型形成，肾小管扩张。

三、IR损伤后肾实质中抗氧化物质蛋白质表达

血红素氧化酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是抗氧化标志物，在IR损伤后72 h，治疗组肾组织HO-1蛋白表达明显高于模型组(图3A)。磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶1(NAPDHquinineoxidoreductase-1，NQO-1)是另一种抗氧化标志物，在IR损伤后72 h，治疗组肾组织NQO1蛋白表达高于模型组(图3B)。

注：图A：诱导IR后24h、72h，治疗组血肌酐水平较模型组均明显降低，差异有统计学意义(aP<0．05)。图B：诱导IR后24h，模型组、治疗组尿量与对照组比较，差异无统计学意义(P>0．05)；诱导IR后72h，治疗组尿量与模型组比较明显增多，差异有统计学意义(bP<0．05)。图C：诱导IR后24h、72h，模型组与治疗组尿白蛋白/肌酐比值比较，差异有统计学意义(cP<0．05)。图1 诱导IR后24h、72h，3组血肌酐、尿量和尿白蛋白/肌酐比值的变化

注：对照组、模型组、治疗组肾脏局部HE染色(200×inA，B&C；400×inD，E&F)；与其他组比较，未模型组呈现高程度的肾小管刷状缘减少、管型形成、肾小管扩张图2 IR后72h各组大鼠肾脏局部结构

注：1为对照组，2为模型组，3为治疗组图3 抗氧化标志物的蛋白表达

讨 论

IR损伤有关的患者病死率一直居高不下，临床上也缺乏有效的治疗手段。一旦肾小管损坏严重而不能完全恢复，就可能进入慢性肾衰竭阶段，需长期或终身行肾脏替代治疗或肾移植。IR损伤的病理生理机制非常复杂，是炎性细胞、血管内皮细胞和细胞因子等多方面相互影响作用的结果。近年来间充质干细胞治疗IR损伤成为研究热点，已有研究表明间充质干细胞可以改善肾脏缺血再灌注所致的肾损伤[7-8]。在缺血再灌注模型的研究中发现MSCs可通过旁分泌抗凋亡因子、促有丝分裂因子及血管生成因子等在调节免疫、参与血管重建、修复肾脏损伤微环境等方面有重要作用。在最近对不同来源的间充质干细胞的研究中发现，ADMSCs具有更多的临床应用潜能，它可来源于自体，容易在体外大量扩增，可迁移到受损部位，产生大量抗炎症细胞因子和生长因子，并且拥有免疫调节特性，这些赋予了它比其他类型干细胞更大的潜能和优势[9-11]，且ADMSCs相比较于脐带或脐血来源的干细胞更容易实现自体移植，故本研究为ADMSCs治疗IR损伤提供了一定的思路和实验依据。

在实验设计上为了验证ADMSCs对肾脏IR损伤的治疗修复作用，我们设计了对照组；模型组为单纯的IR组，观察建模是否成功；治疗组验证ADMSCs对IR所致的肾损伤的修复作用。本研究结果显示，IR建模后，血清肌酐及尿蛋白/肌酐比值开始升高，24 h达到高峰后开始降低，ADMSCs组在72 h后已接近正常组数值，这都说明ADMSCs能显著降低大鼠IR的肾损伤，并且从肾脏组织病理切片染色也能观察到ADMSCs注射能显著降低肾损伤，表明其对大鼠IR损伤的治疗作用。

在对肾损伤的机制研究中发现，氧化应激是诸多肾脏疾病模型的发病机制，而核转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2(nuclear factor erythroid-2p45-related factor，Nrf2)和抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)是研究机制中最重要的信号通路之一。Nrf2-ARE信号通路通过调控下游靶基因和重要解毒酶靶基因的转录从而起到保护作用，其中HO-1和NQO-1是Nrf2-ARE信号通路中重要的下游靶基因[12]：HO-1可催化形成胆绿素、胆红素、铁离子。胆绿素和胆红素是体内强有力的自由基清除剂，具有广谱抗氧化能力，而铁蛋白是细胞内抗氧化损伤能力的保护剂[13]；NQO-1借助烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为电子供体，催化醌类物质发生还原反应，降解醌类及其衍生物，阻止其进一步参与氧化还原反应和活性氧的产生，发挥抗氧化应激作用[14]。Wu等[15]的研究表明在肾脏缺血再灌注的条件下，与Nrf2基因敲除小鼠相比，野生型小鼠促进Nrf2下游基因包括HO-1及NQO-1的表达从而达到抗细胞凋亡的作用，同时野生型小鼠的肌酐和尿素氮等反映肾损伤的指标明显好转，并且用Nrf2的小分子诱导剂(抗氧化剂谷胱甘肽和N-乙酰半胱氨酸)预处理野生型和Nrf2基因敲除小鼠，只有野生型小鼠的肾损伤得到改善。这表明Nrf2在IR所导致的氧化应激造成的肾损伤有显著的保护作用[16]。

本研究显示IR建模72 h后，治疗组的HO-1和NQO-1蛋白表达水平高于对照组及IR组，有趣的是其与肾损伤生物学指标(血肌酐及其与蛋白的比值)和组织学结果一致，提示为应对IR损伤后一系列肾脏损伤过程，ADMSCs的注射通过诱导HO-1和NQO-1蛋白表达增多来增强了大鼠的抗氧化能力及抗损伤能力，与Wu 等[15]所报道的结果一致。

综上所述，ADMSCs的移植可以治疗急性IR所导致的肾损伤，其通过抗氧化应激保护肾功能，促进损伤肾组织细胞再生，在肾衰竭及其他肾脏疾患的肾实质细胞修复中意义重大。

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Protective effect of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells on renal ischemia reperfusion injury

HUANGKe-jing,HUANGTing,HUWen-bing,XIANGLi-na.

TheKeyLaboratoryofKidneyDiseasesPreventionandInterventionofHubeiProvince,HuangshiCentralHospital,EdongHealthcareGroup,Huangshi435000,China

Corresponding:HUWen-bing,E-mail:huwenbing75@sina.com

Objective To observe the protective effects of tail veil injection of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells(ADMSCs) on the renal ischemia reperfusion(IR) injury of rats.Methods Adult male Sprague-Dawley (SD) rats(n=24) were equally randomized into sham operation group(sham control), IR injury model group(IR plus saline only), and cell therapy group(IR plus intravenous administration of 1.0×106autologous ADMSCs),n=8 each group. Fourteen days before IR, the adipose tissue around the greater omentum was cut for the preparation of ADMSCs. Twenty-four h before modeling, serum creatinine, urine volume and urinary albumin/creatinine ratio were evaluated as blank controls. The renal IR injury model was set up. In the sham group, the middle incision was cut and sutured. One h after IR, ADMSCs were transplanted through tail vein of rats in cell therapy group, and the same volume of normal saline was injected into the rats of sham operation group and model group. The renal functional indexes including serum creatinine, urine volume and urinary albumin/creatinine ratio were detected by biochemical method 24 h and 72 h after IR. The pathological changes were observed by HE staining, and the relative expression of HO-1 and NQO-1 was detected by Western blotting.Results The results of biochemical detection(serum creatinine and urinary albumin/creatinine ratio) showed that the kidney function of rats in cell therapy group was significantly better than in model group(P<0.05). The histopathological observation showed that the obvious morphological damage was observed in the renal tubule in model group, and amelioration was observed in cell therapy group. Western blotting showed notably higher expression of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1(NQO1) and HO-1 proteins, two indicators of anti-oxidative capacity, in cell therapy group than in model group.Conclusions ADMSCs therapy minimized kidney damage after IR injury through suppressing oxidative stress.

Kidney ischemia reperfusion injury；Adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs; Rat; Heme oxygenase-1

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.02.010

湖北省自然科学基金(No.2015CFB473)；黄石市科技计划项目(No.2015B046-4)；肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室开发基金项目(No.SB201601)

435000 湖北省黄石市中心医院肾脏内科(黄克静，黄婷，向丽娜)；肿瘤内科(胡文兵)

胡文兵，E-mail：huwenbing75@sina.com

2016-12-09

2017-02-03)