运动疗法联合中药复方对CHF大鼠AngⅡ的影响

2017-04-10礼海，马金，张洋，张艳

中西医结合心脑血管病杂志 2017年5期

礼海，马金，张洋，张艳

礼海1，马金2，张洋3，张艳3

目的观察运动疗法联合中药复方对慢性心力衰竭(CHF)大鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的影响。方法建立大鼠CHF模型，检测AngⅡ、1型受体(AT1)等，通过药物及运动方案进行干预，利用实时荧光定量PCR及蛋白印迹法等分析标本。结果 AngⅡmRNA表达中药加运动组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。AngⅡ蛋白表达中药组、中药加运动组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；AT1蛋白表达中药组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，中药加运动组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 AngⅡ，AT1是导致心肌重构的重要靶点，运动疗法加中医药治疗CHF具有较好疗效，可促进病人提高生活质量，具有减毒增效的作用。

慢性心力衰竭；中药复方；运动疗法；血管紧张素Ⅱ；1型受体；心肌重构

随着基础研究持续深入，卫生医疗条件普遍改善，人均寿命不断增长；传染性疾病发病率不断下降，同时社会生活节奏加快，环境与心理多因素导致心血管疾病发病率逐年升高，已成为我国居民首要死亡原因，特别是以慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)为代表的慢性疾病[1]。在临床治疗中多采用药物治疗，西医药物短期效果明显，但具有较大的毒副作用；中医药治疗有效但理论机制尚不明确，运动治疗方兴未艾[2]。而相关研究证明血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)参与CHF的发生与发展，通过分析AngⅡ、1型受体(AT1)等指标，探讨研究运动疗法联合中药复方对CHF及心肌重构的影响，为今后中医药开发与疾病进一步治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物从辽宁中医药大学动物实验中心购进，普通级12周龄体重200 g～220 g雄性SD大鼠80只，合格证为辽实动2008-0018。

1.2 实验药物参照2010年版国家药典[3-4]规定选取药材，参草通脉颗粒(黄芪、人参、红花、丹参、益母草、三七粉、葶苈子，比例3∶1∶1∶2∶2∶1∶1)批号辽药制Z0901013，委托辽宁华源本溪三药有限公司生产。盐酸贝那普利片(北京诺华制药有限公司生产，国药准字H20030514)，每片10 mg。

1.3 造模方法使用10%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔麻醉[5]，经气管插管术后迅速连接小动物呼吸机。大鼠皮肤经消毒后，在鼠左侧第3肋间横切长1.5 cm，钝性分离肌肉，充分暴露心脏，于鼠左冠状动脉前降支起源点3 mm处进行结扎，观察心电仪，如胸前导联ST段及T波显著异常，迅速分层缝合，在每层肌肉缝合中及伤口处敷淋洒注射用青霉素钠，大鼠自主呼吸恢复后，吸痰，停呼吸机。前3 d注射青霉素钠每日1次，每次2×105U。常规喂养7 d，第8天起饲料减半；每天游泳至其疲乏，每日1次，共28 d。第29天经多普勒超声心动图检测左室射血分数(LVEF)，LVEF≤60%可诊断为心力衰竭[6]，出现精神萎靡，毛色无光泽列入观察对象。

1.4 实验方案造模成功大鼠，按体重依次排序编号，采用数字随机表求余数法分为中药组、西药(盐酸贝那普利)组、模型组、中药加运动组、运动组，每组8只。中药加运动组、运动组与尚未分组且造模成功的大鼠进行适应性运动3 d，不适应跑台的中药加运动组与运动组大鼠剔除出组，由未分配组别且适应跑台、体重接近的大鼠替代，保证每组有8只大鼠。对照(假手术)组仅行开胸，钝性分离暴露心脏，冠状动脉前降支起源点2 mm～4 mm处用线勒紧5 s后松开；后70 d常规饲养。对照组、模型组和运动组大鼠不用药，每日两次常规等容积灌胃蒸馏水；余各组大鼠按人鼠剂量换算公式：剂量(g/kg)=人的剂量(g)×系数(0.018)/动物体重(kg)灌胃给药[7]。中药组与中药加运动组，每日2次灌胃给予参草通脉颗料、7.2 g生药/(kg·d)；西药组给予盐酸贝那普利片首次灌胃1.2 mL生药/kg，第2次灌胃1.2 mL蒸馏水，用药42 d。

1.5 大鼠运动试验方案大鼠进行适应性训练第4天行正式运动，采用Bedford鼠体重/摄氧量回归方程建立ET模型。耐受负荷(Ek)=m·V2/2(m为大鼠质量，v为速度)；潜能(Ep)=m·g·v·t·sinψ(g为重力加速度量，t为时间，ψ为倾斜度)，二者相加之和为运动耐量ET。跑台倾斜角度为15度，10 m/min(相当于最大氧摄取45%VOzmax)。首次15 min，第2次为30 min，第3次为45 min[8]。运动48 d，每日1次。

1.6 主要试剂及仪器 6周后禁食、不禁水12 h，麻醉处死全部大鼠。取大鼠心肌组织，每只大鼠心肌按标准处理分为若干份，每份100 mg，用于实时定量荧光PCR技术、蛋白印迹分析法检测AngⅡ、AT1，并于液氮-80 ℃条件下保存待测。

PCR试剂盒由大连TaKaRa公司生产；7500型实时荧光定量pcr仪，由美国Bioneer公司生产；PCR扩增仪，由德国Biometra公司生产。

1.7 实验步骤

1.7.1 实时荧光定量PCR操作根据实验操作流程，应用ABI7500扩增仪分析结果并计算。利用Prime5.0软件设计引物序列、扩增产物长度如下表1。

表1 引物序列

1.7.2 蛋白印迹法(Western Blot)实验步骤按照试剂盒及仪器要求的操作步骤进行,采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件分析定量。

1.7.3 实时定量荧光PCR数据采用相对定量法计算，用2-ΔΔCt(Livak)方法比较经处理的样品和未经处理的样品目标转录之间的表达差异。公式：△CT(正常)=CT(正常校正样本)-CT(正常参照样本)；△CT(实验)=CT(实验目标样本)-CT(实验参照样本)；2-ΔΔCt=△CT(实验)-△CT(正常)计算，计算结果为实验样本表达比正常样本表达的倍率。

2 结果

实验各干预方案对CHF大鼠心肌组织对AngⅡ、AT1 mRNA表达与蛋白表达的影响，mRNA表达中AngⅡ、AT1中药组、西药组、中药加运动组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.001)；AngⅡ、AT1中药组与西药组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；AngⅡ中药加运动组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；AT1中药加运动组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图1。

图1 荧光PCR触解曲线

蛋白表达中AngⅡ、AT1中药组、西药组、中药加运动组、运动组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.001)；AngⅡ中药组、中药加运动组与西药组比较，AT1中药加运动组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；AT1中药组与西药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2、表1。

注：1为对照组；2为模型组；3为运动组；4为西药组；5为中药组；6为中药加运动组。图2 Western Blot条带图

表1 各组CHF大鼠心肌组织对AngⅡ、AT1 mRNA表达与蛋白表达影响的比较

3 讨论

近年对CHF研究认为是以肾素-血管紧张素系统(RAS)激活，出现神经内分泌基因调控异常，联合多种病理因素参与的心肌超负荷运行机制[9]。初期RAS系统通过AngⅡ实现强烈血管收缩、增加醛固酮分泌、促进心肌细胞增生，平衡容量和压力负荷维持正常心功能。有报道证实[9]AngⅡ过度表达造成心肌肥大和诱导心肌细胞凋亡，是导致CHF重要且相对独立、特异的因素。对细胞直接注射AngⅡ[10-12]，在不依赖血流动力学改变情况下可使心肌显著增厚，心肌收缩功能降低、硬化，发生心肌重构，造成CHF发生。AngⅡ主要与AT1结合而产生具有增加正性肌力及频率等作用，通过自分泌与旁分泌促进心肌增生及重构，因此两者是导致CHF发生的重要靶点。相关实验发现，CHF发生时AngⅡ表达明显增加[13-14]，多作用于心肌细胞膜上AT1受体，而AT2基本无意义，可导致AT1 mRNA及蛋白表达升高，导致心肌细胞发生迅速增殖，且细胞体积增大，而心肌产生重构等[16-18]。

本实验发现，模型组实验大鼠AngⅡ、AT1 mRNA及蛋白表达均显著增加，而对照组未见明显增加，证明AngⅡ、AT1与CHF密切相关。而其余治疗组检测结果均优于模型组，说明药物等治疗方法有效。中药加运动组效果较为突出[19]。过去关于CHF病人强调注意休息，减少运动；近期研究发现适当运动有利于CHF恢复[20-21]。但相关研究较少，在本实验进行尝试，认为康复运动应配合药物治疗，单纯运动康复暂不推荐。在药物控制基础上，运动疗法有助于病人恢复；提高心肌有效做功，为机体有效泵血提高供氧，恢复心脏功能[22-23]。中医和西医均是有益尝试。

本实验中药加运动组较单纯中药组AngⅡ、AT1水平下降显著，可能与交感神经兴奋呈正相关，与动脉压负相关，增加射血分数，促进循环有利于氧气交换，调节心肌细胞外基质，可延缓或阻断心肌重构，降低神经兴奋，提高最大耗氧量，增加心输出量，提高生活质量，降低住院率[14]。中药效果与西药相当，中医药治疗更重视整体调节。在临床治疗中，西药多以利尿剂为主，配合强心药物，长期服用具有明显毒副作用，且随着使用时间延长临床疗效受到影响。

中药具有增效减毒的作用，心衰为病，多心气不足，运血无力，气虚血瘀为病，用以益气活血之法。故治疗多用益气活血之品，毒副作用小。黄芪、人参具有补气益气之功，黄芪甲苷、多糖等具有正性肌力、抗心律失常、扩张血管、降低血小板黏附率及降血脂等作用；红花、三七活血为上；丹参具有补气行血，活血祛瘀，通经止痛，现代研究认为丹参酮有活血保护心肌，改善供血之力，与人参配伍具有强心、扩冠脉、调心率、抗凝结等作用；益母草活血利水，通经络；葶苈子祛痰平喘，利胸中之水；三七具有调节血压等作用。全方益气活血，综合调节，营养心肌，兼治相关并发症，一举多得。从整体调节心脏功能优于西药固定靶点调节治疗[24]。通过实验结果证明：中药联合运动疗法能明显改善心肌重构，有效恢复心功能,且对CHF治疗疗效较为明显。因此在临床治疗中，以药物治疗为基础，若病情稳定应尽早加入康复运动疗法，通过有计划的运动训练提高心肌与全身供氧，可有效恢复心肌功能。改变传统单纯保守药物治疗，避免运动的观念。

综上所述，今后治疗使用中西药物应综合病人病情多角度分析，考虑药物兼容性，在运动方面如5 min步行法，太极拳原地运动简易招式，根据病情循序渐进，综合治疗方能取得较好疗效[25-26]，并配合运动康复治疗有利于CHF病人康复。

[1] 王玮，陈彬，黄从新.充血性心力衰竭的治疗进展[J].山东医药，2007，47(34)：115-116.

[2] 礼海，张艳，马金.益气活血复方联合运动疗法对慢性心力衰竭大鼠心肌组织MMP-1及Ⅲ型胶原表达的影响[J].中国中西医结合杂志，2011，31(7)：955-960.

[3] 黄忠钧，张艳，孟宪生，等.参草通脉颗粒丹酚酸B提取工艺研究[J].中国中医药信息杂志，2013，20(2)：57-58.

[4] 黄忠钧，张艳，孟宪生，等.参草通脉颗粒丹参酮ⅡA提取工艺研究[J].中国现代药物应用，2012，6(20)：8-9.

[5] 李春，欧阳雨林，王勇，等.益心解毒方对心梗后心衰大鼠心肌保护作用的实验研究[J].中华中医药杂志，2012，27(11)：2966-2969.

[6] Burrell LM，Chan R，Phillips PA，et al.Validation of anechocardiographic assessment of cardiac function for lowing moderate size myocardial infarction in the rat[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，1996，23(6-7)：570-572.

[7] 秦川.实验动物学(八年制)[M].北京：人民卫生出版社，2010：186-188.

[8] 马力，刘杰，初楠，等.用运动试验评价心力衰竭模型大鼠心功能[J].首都医科大学学报，2007，28(3)：350-354.

[9] 廖佳丹.益气活血复方对慢性心衰大鼠心室重构AT1-ERK2影响的实验研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2013：41-48.

[10] Zucker IH，Wang W，Brandle M，et al.Neural regulation of sympathetic nerve activity in heart failure[J].Prog Cardiovasc Dis，1995，37(7)：397-414.

[11] 张洋.益气活血复方对慢性心衰大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原表达影响的实验研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2011：42-43.

[12] Semen GG，Boddi M，Cecioni I，et al.Cardiac angiotens information in the clinical course of heart failure and its relationship with left ventricular function[J].Circ Res，2001，88(9)：961-968.

[13] 马金.益气活血复方联合运动训练对慢性心衰大鼠的心功能及左室重构影响的实验研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2011：70-72.

[14] 马金，张艳，礼海.益气活血复方配合运动训练对慢性心衰大鼠心肌组织MMP-1、Ⅲ型胶原蛋白影响的实验研究[J].辽宁中医杂志，2011，38(5)：863-865.

[15] 刘晓蕾，张艳，礼海.益气活血中药对心力衰竭大鼠MMP-1、TIMP-1影响的实验研究[J].天津中医药，2011，28(6)：503-505.

[16] 马金，张艳.益气活血复方对慢性心衰大鼠心肌重构影响的实验研究[J].时珍国医国药，2011，22(6)：1361-1362.

[17] 张艳，宫丽红，钱新红，等.慢性心衰中医分期分级临床辨证体会[J].辽宁中医杂志，2010，37(5)：801-802.

[18] 黄飞翔.中医治疗慢性心衰的探讨[J].中西医结合心脑血管病杂志，2013，11(1)：90-91.

[19] 张艳，礼海，王彩玲.慢性心衰气虚血淤临床辨证规律研究[J].时珍国医国药，2010，21(12)：3040.

[20] 韩额尔德木图，马月宏，王海燕，等.慢性心衰的病理生理及发病机制研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(12)：1349-1352.

[21] 礼海，张艳.强心通脉颗粒对慢性心衰大鼠心肌组织AngⅡ及TXB2影响的实验研究[J].辽宁中医杂志，2009，36(10)：1802-1804.

[22] 王懿，张艳，礼海.益气活血方干预PGC-1α调控心衰心肌细胞能量代谢重构的作用机制[J].中国实验方剂学杂志，2015，21(6)：169-173.

[23] 刘秀娜，张艳，礼海.益气活血复方对心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌能量代谢的影响[J].天津中医药大学学报，2015，34(1)：23-26.

[24] 薛丽萍，张艳，孙科峰，等.强心通脉颗粒剂小鼠急性毒性实验分析[J].中国现代药物应用，2010，4(1)：53-54.