验证活细胞膜选择透过性的简易方法

崔荣荣 何奕騉 郭琪琦

（1首都师范大学生命科学学院 北京 100048 2深圳市第二实验学校 广东深圳 518021）

细胞膜又称细胞质膜，是指围绕在细胞最外层，主要由脂类和蛋白质组成的一层极薄的膜。细胞膜不仅是细胞结构的边界，使细胞具有一个相对稳定的内部环境，同时在细胞与环境进行物质运输、能量转换，以及信息传递过程中也起着决定性的作用。细胞膜是细胞与周围环境进行选择性物质交换的屏障与通路[1］。可以说认识整个细胞乃至生命体从细胞膜开始。

细胞膜是选择透过性膜，大分子物质不能通过活细胞膜。细胞膜控制物质进出这一重要功能，在高中生物学概念体系中非常关键，有利于学生理解细胞膜的选择透过性这一重要概念，同时帮助学生理解细胞膜是系统的边界。中学教师和学生对于台盼蓝试剂有所耳闻，“台盼蓝拒染实验”也多次作为高中试题的考查材料，但具体实验过程和实验结果并未见相关报道。同时实验中需要运用活细胞系，由于一般学校没有细胞培养室，单个的动物活细胞不便于培养和获取。笔者运用高校资源，根据实验目的改进了大学教材中 “台盼蓝拒染实验”，通过实证研究设计并记录实验过程，展示具体直观的过程与结果，填补了高中教材中大分子物质不能随意进出细胞膜的实验空缺，为细胞膜控制物质尤其是大分子物质进出提供了实验依据，验证了活细胞膜具有控制物质进出细胞的功能，为高中教师开展教学提供教学参考资料。

1 实验材料

1.1 主要试剂 浓度0.4%台盼蓝50 mL。台盼蓝（Trypan Blue）或称台盼兰、锥虫蓝、曲利苯蓝。分子式：C34H24N6O14S4Na4，分子量:960.82，属于大分子物质，无法随意进出活细胞膜。因此它可以作为细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性[3］。一般细胞膜完整性发生改变，会导致细胞死亡。因此台盼蓝也常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。冰甲醇：－20℃预冷的浓度100%的甲醇，常被用作细胞固定液。通过结合蛋白质形成沉淀，使得蛋白质发生不可逆转变性，从而改变细胞膜的通透性，同时固定保持细胞形态，便于染色观察。由于蒸馏水不能调节盐平衡，会破坏生物蛋白的结构及生物特性，生理盐水不能调整pH，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，而磷酸缓冲盐溶液（PBS）具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，一般用PBS稀释有活性的生物制剂。本实验用PBS作为冲洗液。

1.2 细胞株及常规培养 骨肉瘤细胞株 （U-2OS），由首都师范大学生科学动物细胞实验室提供。该细胞的特点是细胞核大，细胞形态圆润，实验效果明显。接种细胞之前在培养孔里加入盖玻片，将细胞接种于盖玻片上，使细胞在盖玻片上贴壁培养，这样设计便于实验处理之后，直接将盖玻片扣在载玻片上进行制片观察。在培养孔中加入血清和双抗的高糖DMEM培养基，37℃，CO2培养浓度为5%，培养密度 5×105，培养24 h。单层细胞均匀覆盖在盖玻片表面，细胞状态健康。

2 实验步骤

2.1 冰甲醇固定坏死处理 用压力泵吸除骨肉瘤细胞培养基后，PBS清洗残留培养基。将载有细胞的盖玻片分为左、右2个部分，左边细胞作为对照组，保持活性；右边作为实验组，用一小滴冰甲醇处死并固定细胞，时间控制在5 s即可，用PBS冲洗2～3遍，尽量不污染活细胞。

2.2 贴壁细胞的原位台盼蓝染色实验 吸除培养盘中多余的PBS，在盖玻片左右2个部分都滴加台盼蓝，完全覆盖细胞，同时进行染色，室温染色约3 min即可，吸除台盼蓝，用PBS冲洗染料2～3次。立即制作装片观察并拍照。

3 实验结果与讨论

3.1 结果 未经冰甲醇处理的细胞，细胞膜完整，不能被台盼蓝染色（见图1，本文附图见插页2）；经过冰甲醇处理的细胞，细胞膜丧失完整性，被台盼蓝染成蓝色（见图2）。图3则显示了实验组和对照组对照实验交界处，对比明显（图1～图3均为物镜40倍下观察，图片比例尺20 μm）。

3.2 讨论 经过冰甲醇处理，细胞膜的通透性变大，失去控制物质进出的能力，大分子物质台盼蓝进入细胞，使得细胞染上蓝色。未经冰甲醇处理的细胞，细胞膜完整，台盼蓝分子不能进入染色。

此次动物细胞实验的创新之处在于借鉴了传统的台盼蓝拒染实验中试剂的使用，但在此基础上大胆进行了改进，尤其是在实验操作和新试剂的使用方面。实验试剂浓度和实验时间经过多次摸索得出，可重复。实验优点在于：

1）未将贴壁培养的细胞用胰蛋白酶消化下来，直接在细胞贴壁原位进行实验。原实验胰蛋白酶消化细胞会对细胞的活性有很大影响，酶反应的时间不可控，时间过短消化出的细胞较少。时间较长，对细胞有毒性作用，会破坏细胞膜上的糖蛋白，导致细胞死亡过多，影响实验效果。

2）创造性地运用冰甲醇固定液，破碎细胞膜同时固定死细胞。原台盼蓝染色实验，破膜严重的细胞多次冲洗后会飘走，原位实验不改变细胞的位置，直接处理，操作简便，效果明显。

3）将细胞直接种植在盖玻片上，并根据对照原则将盖玻片上长势相同的细胞分为左、右2个部分，一部分做破膜处理，一部分保持活性，同时染色，显微镜下直接对比，结果更明显。

4）在细胞染色后用重悬液PBS进行漂洗，洗去浮色后，在显微镜下观察，这个步骤优化了台盼蓝拒染实验。原实验在观察细胞染色情况时，直接吸取混有台盼蓝溶液的细胞液，直接观察，视野整体蓝色，不利于观察细胞染色情况。

实验的不足在于实验所用的细胞材料不易获得；同时细胞在脱离了适宜的培养环境时，死亡较快，因此对实验者的操纵技能要求较高。鉴于实验结果明显，可以为中学教师教学提供参考。