梨树胶孢炭疽病生防菌筛选及其抑菌活性初步评价

钱鑫磊 周珊珊 张冬乐 梅 侣 刘 普*

（1合肥一六八中学 安徽合肥 230601 2安徽农业大学园艺学院 安徽合肥 230601）

梨炭疽病是严重危害梨树的一种真菌病害，主要危害果实，较少危害叶片、枝条，严重时可导致枝干枯死、早期落叶和果实腐烂[1］。近几年，江西、浙江、安徽、江苏、福建等南方砂梨产区因炭疽病造成的早期落叶也非常严重，部分产区因早期落叶造成的二次开花等致使梨园完全失去产量。目前生产上应对炭疽病的防治策略主要侧重于化学药剂防治。常用的化学药剂为波尔多液、代森锰锌、三唑类杀菌剂及甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂等[2］。但化学杀菌剂危害人类健康，农药的使用量的增大，呈现出用药量与病虫害不断递加的恶性循环[3］。因此，探求一种新型、安全的手段替代现有的化学杀菌剂尤为重要。生防菌对人畜安全、环境兼容性好，使病原菌不易产生抗药性，可有效减少果品中农药残留量，正逐渐成为生产上抗病的新兴力量[4］。

目前，国内、外科研人员已经分离筛选一些表型较好的生防芽孢杆菌，Arima等[5］首次发现枯草芽孢杆菌可表现出抗病毒、抗支原体和一定程度的抗细菌活性，Liang等[6］发现蜡状芽孢杆菌对葡萄孢菌有较好的抑制作用，其发酵液对该菌株的抑制率为 75.8%。但目前尚未发现甲基营养型芽孢杆菌在梨胶孢炭疽病上的相关报道，本文就梨生防菌的分离纯化、筛选及16S r DNA菌种鉴定进行初步研究，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试梨品种 砀山酥梨，取自安徽省合肥市高新技术农业园果树实习基地。

1.2 供试菌株 胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），由安徽农业大学果树重点实验室提供。

1.3 培养基 真菌选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、细菌选用LB培养基、放线菌选用改良高氏1号培养基。

1.4 菌株分离、纯化和培养

1）一年生枝条及叶片内生真菌的分离。

表面消毒：将实验材料用流水冲洗后，转至无菌工作台，表面依次用75%酒精消毒1次（20 s）、无菌水漂洗1次。

病健分离：用灭菌手术刀切取病健交界处，枝条选择木质部，长约7～8 mm，宽约2～3 mm；叶片选择病健交界处约边长为5 mm的正方形小块，小心贴置在PDA培养基上，封口后于25℃恒温培养。

2）一年生枝条及叶片细菌的分离。将切取的组织依次用75%酒精、无菌水、次氯酸钠、无菌水、无菌水浸泡3～5 s后，在无菌条件下，加入适量无菌水对组织进行无菌研磨后涂布于LB平板培养基上，于28℃恒温培养箱中培养48 h后挑取单菌落，接种于4 m LLB液体培养基中，160 r/min、28℃振摇 24 h 备用[7］。

3）土壤中微生物的分离。将取回的土壤称取2.0 g溶解于100 mL无菌水中，依次将浓度稀释度调至 10-1、10-2、10-3、10-4，各取 0.1 mL 用涂布棒均匀涂布于LB平板上，置于28℃恒温培养箱进行培养[8］。

4）内生真菌和细菌的纯化。将分离微生物时接种的PDA培养基培养4～7 d，待组织周围长出菌落后，真菌根据菌落长出时间的先后、形态和颜色，采用菌丝尖端挑取法及时挑取材料边缘菌丝转接于新培养基上培养，不断纯化后置于4℃保存备用；细菌、放线菌纯化用平板划线法。

5）生防菌筛选。采用对峙生长法检测分离得到的所有微生物对梨胶孢炭疽菌的抑制效果。病原菌胶孢炭疽病菌在PDA培养基、25℃恒温培养箱培养5 d，沿菌落边缘以6 mm灭菌打孔器打出菌饼置于空白PDA平板中心，在距平板边缘25 mm处呈十字交叉形位置接相同直径的菌饼，设空白对照，对照菌饼用直径为6 mm的PDA培养基，每处理重复3次。待对照平板菌落将要长至平板边缘时测各处理菌落直径，计算抑制率。抑制率（%）＝（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/（对照病原菌菌落直径-6）×100。

6）拮抗放线菌发酵液的制备。拮抗放线菌接种于50 mL LB液体培养基，25℃ 200 r/min培养48 h，将放线菌培养液于5 000 r/min离心10 min后，取上清为拮抗放线菌发酵液，用放线菌过滤器过滤后得到拮抗放线菌无菌发酵液。

7）常用杀菌剂和生防菌对病原菌抑菌活性的测定。在无菌工作台配置PDA培养基并灭菌，待温度降至50°C左右时按各药剂推荐使用浓度（80%波尔多液可湿性粉剂400倍液、50%福美双水分散粒剂700倍液、75%百菌清可湿性粉剂400倍液、3%噻霉酮400倍液）加入相应数量药剂混匀倒板，加入的生防菌发酵液浓度为1×109CFU/mL，每个PDA平板最终培养基体积约10 mL。待培养基冷凝后，采用内径为6 mm的打孔器取相同大小的梨胶孢炭疽菌菌饼，转接到各处理的PDA培养基中心，重复3次，于25℃培养箱恒温培养，以加入相同体积的无菌水为对照。每隔24 h观察记录一次、测量各处理菌落直径，待对照板长满时测量并计算各处理对菌丝生长的抑制率。吸取分生孢子浓度约为1.0×106个/mL的悬浮液20 μL滴于干净的凹玻片上，再分别加入杀菌剂推荐使用浓度的2倍液、浓度为1×109CFU/mL的生防菌发酵液各20 μL，混匀，置于25℃恒温培养箱中培养，对照以无菌水代替杀菌剂。培养12 h后，在显微镜下观察并统计各处理下分生孢子萌发率[9］。

8）生防菌种属鉴定。以提取的菌株基因组DNA为模板，采用16S区通用引物27F/1492R对获得的菌株16S片段进行PCR扩增。引物27-F：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3′；1492-R：5′－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3′。 PCR 反应条件：94℃ 3 min；94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 90 s，34个循环；72℃ 7 min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测得的rDNA-16S基因序列在NCBI网站上进行同源性Blast比较。

2 结果与分析

2.1 微生物的分离与筛选 从采集的样本中共分离到313株，分布比例为病叶、健叶、病枝、健枝、土壤，微生物在土壤、病叶、病枝分布较多。平板对峙实验统计显示微生物中拮抗能力较强的有3个，占0.96%；有拮抗能力的有15个，占4.79%；无拮抗能力的有295个，占94.25%。拮抗效果最好的为RT-30，因此选择RT-30做了进一步的离体和活体抑菌效果研究（图1）。

图1 RT-30对梨胶孢炭疽病菌的拮抗作用

2.2 生防菌RT-30对梨炭胶孢疽病菌菌丝生长及孢子萌发的抑制效果 同时培养6 d后发现，RT-30对炭疽病菌菌丝的抑制效果明显高于80%波尔多液可湿性粉剂400倍液，接近于400倍液的75%百菌清可湿性粉剂，在前3 d对炭疽病菌菌丝的抑制效果趋于一致，菌丝在第4～6天几乎停止生长，在加入RT-30的培养基中，尽管菌落直径扩大，但菌丝生长力极弱（图2）。

图2 RT-30对梨胶孢炭疽病菌菌落生长的抑制作用

RT-30和不同杀菌剂对胶孢炭疽病菌菌丝的生长抑制作用有显著差异，RT-30的抑制率达到65.50%，明显高于抑制率为21.86%的80%波尔多液可湿性粉剂400倍液；通过对胶孢炭疽病菌分生孢子各处理发现，3%噻霉酮300倍液处理下的孢子萌发率为0%，说明该药剂对胶孢炭疽菌分生孢子的萌发起着极为明显的抑制作用，50%福美双可湿性粉剂700倍液、75%百菌灵可湿性粉剂400倍液和RT-30对炭疽病孢子的萌发一定的抑制效果，均与清水对照差异显著（表1）。

表1 杀菌剂与生防菌RT-30对胶孢炭疽病菌菌丝生长的抑制作用

2.3 拮抗细菌的种属鉴定 序列比对结果显示，拮抗菌 RT-30的 16S rDNA序列与Bacillus methylotrophicusMo-Bm HQ325853同属一支。结合形态学比较可以得出RT-30为Bacillus methylotrophicus。

3 讨论

甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus是Madhaiyan等[10］自水稻根系土壤中分离得到的芽孢杆菌属新成员；吕倩等[11］首次从海洋中分离得到，并证实此菌具备较强抑制黄瓜炭疽病菌等病原真菌活性的能力，有防治作物真菌病害的利用潜质；采俊香等[12］在抱茎苦荬菜中分离出了甲基营养型芽孢杆菌，其抗菌蛋白对番茄早疫病、梨黑斑病和番茄灰霉病具有较好抑制效果，抑菌率分别为 88.3%、90.5%和 95.4%；庄春等[13］在进行该菌可湿性粉剂防治水稻细菌性条斑病的田间药效试验中发现，在浓度为1 800 g/hm2时，对此病的病指防效为61.8%，防效极显著高于50%氯溴异氰脲酸可溶性粉剂。目前，以甲基营养型芽孢杆菌为主要活性成分的生防制剂（甲基营养型芽孢杆菌9912，华北制药集团爱诺有限公司）已被开发成产品防治黄瓜灰霉病，并于2015年12月获得了登记。

本研究离体抑菌结果表明RT-30具有明显抑制菌落生长的活性，通过与普通药剂比较实验，显示RT-30可以抑制菌丝生长和孢子萌发，因此，具有潜在商业使用价值。前人研究显示甲基营养型芽孢杆菌具有分泌抗菌性活性物质酯肽的能力。酯肽已被证实具有抑制菌丝生长和孢子萌发的能力，相比于化学合成农药，酯肽具有易降解、环境友好等特点[11－12］。 目前，还未见甲基营养型芽孢杆菌在防治梨树病害的相关报道，本研究明确了甲基营养型芽孢杆菌对梨树炭疽病的防治作用并与常用药剂比较了可能的作用机理，为下一步的抗菌机制、定殖部位和能力、田间药效、发酵和剂型开发等提供了基础，也为炭疽病的防治提供了新的思路。