果蝇幼虫唾腺染色体标本的制备与比较*

罗玉娥 黎杰强 何风华 高 峰

（华南师范大学生命科学学院 广东广州 510631）

0 前言

唾腺染色体（salivary gland chromosome）是一种具多线性的巨大染色体，因最早在双翅目昆虫的唾腺细胞中发现而得名，又称多线染色体（polytene chromosome）。双翅目昆虫的唾腺细胞分化并发育到一定阶段后就不再分裂，而染色体不断复制，且复制后得到的新染色线与原来的染色体平行排列，最终形成约1 000拷贝的巨型染色体。其长度是有丝分裂中期染色体的150多倍[1］，在显微镜下清晰可见。双翅目幼虫体细胞含4对染色体，但在其唾腺细胞中只观察到4条染色体，这是因为唾腺细胞发生了体细胞同源染色体联会现象，1对同源染色体紧密配对形成1条染色体。经染色后，多线染色体呈一系列明、暗带相间的横纹。每条染色体上横纹的宽窄、数目、排列顺序及疏密程度都因物种不同而异[2］。多线染色体上的疏松区域称为“蓬突”或“泡”，与基因表达紧密相关。除了唾腺，多线染色体也存在于双翅目昆虫的马氏管、肠、脂肪体等组织中；纤毛虫类的大核原基、被子植物的胚乳以及弹尾目、鳞翅目和直翅目的某些特定细胞中也曾发现巨大染色体[3］。由于巨大的形态结构，多线染色体已被广泛应用于生物的细胞遗传、系统分类、基因的定位和克隆及基因结构的研究[4］。

本实验采用双翅目的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫为实验材料。黑腹果蝇具有体型小、易饲养、繁殖快、性状表现极丰富等特点，使其成为奠定经典遗传学基础的重要模型生物之一[5］。多线染色体的研究实验常以果蝇幼虫为材料，除了上述原因外，还因为果蝇幼虫的唾腺易获取、唾腺染色体巨大、数量少（2n=8）、横纹清晰等优点。

在我国，自1983年刘凌云[6］发表多线染色体制片方法的报道以来，陆续有不少研究者探讨制备方法的改进，试图获得更清晰的染色效果、更舒展的染色体臂等。但鲜有报道果蝇唾腺染色体臂的识别、基因突变对染色体形态结构的影响等内容。有鉴于此，本文描述了果蝇唾腺染色体臂的识别、3种品系果蝇唾腺染色体的比较等，主要目的是：确认有效的唾腺染色体辨认方法；研究基因突变对唾腺染色体横纹的宽窄、数目、排列顺序及疏密程度的影响；为实验教学提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 实验所用的3种黑腹果蝇为野生型果蝇（18号）、黑檀体果蝇（e号）和三隐性果蝇（6号），果蝇的表现性状见表1，果蝇突变性状见表2。

表1 3种品系果蝇的表现性状

表2 3种品系果蝇的突变性状

1.2 方法

1.2.1 玉米-琼脂培养基的配制[7］

1）A 液：取糖 62g，琼脂 6.2 g，水 380 mL，煮沸溶解。

2）B 液：取玉米粉 82.5 g，水 380 mL，搅拌溶解。

3）A、B液混合加热，煮沸成糊状，加 0.5 mL丙酸，稍冷却后加入20片研磨成粉状的酵母。

4）分装至 50 mL锥形瓶，高度约 1.5～2 cm，覆两层纱布，用橡皮筋绑紧。

5）冷却后放入5℃冰箱低温保存。

1.2.2 果蝇的培养

1）取装有培养基的锥形瓶6个置于烘箱中，打开通风口和开关，当温度升至60℃关闭开关和通风口。

2）5 h后，取出锥形瓶，进行果蝇接种。

3）18号、e号和6号各接种2个锥形瓶，每个锥形瓶约15只果蝇，贴上注明品系号、接种日期的标签。

4）放入恒温箱中培养，温度设置为23～25℃。

5）3～4 d后，移出锥形瓶中的果蝇。

6）7～9 d后，陆续有乳白色幼虫爬上瓶壁，挑选肥大的幼虫进行实验。

1.2.3 果蝇幼虫唾腺染色体标本的制备[7］

1）腺体剖取：选取虫体肥大的3龄幼虫，置于载玻片上，加几滴0.7%生理盐水，在双目解剖镜下左手持解剖针压住虫体中后部，右手持解剖针按住头部，轻轻向前拉动，使头部扯离虫体，从而拉出唾腺。腺体呈透明囊状结构，位于食管两侧；腺体侧常有乳白色脂肪体，应尽量剔除。

2）解离：载破片上仅留腺体，用吸水纸小心吸去生理盐水，加1滴1 mol/L HCl，解离2～3 min。

3）染色：用吸水纸吸去盐酸，加1滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干。加2滴醋酸洋红或改良品红染液，染色10～20 min。

4）压片：换上新鲜染液，盖上盖玻片，用吸水纸轻轻覆盖玻片。左手固定盖玻片，右手先用手指垂直轻压盖玻片，再用铅笔的橡皮头或解剖针垂直轻敲，或进一步用拇指在盖玻片上适当用力压片，注意勿使盖玻片移动。

5）镜检：在低倍镜下找到分散良好的标本，移至视野中央，转到高倍镜下观察。对染色体分散、横纹清晰的片子进行拍照。

1.2.4 不同果蝇幼虫唾腺染色体的比较 挑选横纹清晰、不变形、染色体臂较为完整的图片，与Lefevre绘制的果蝇唾腺染色体臂的照片图谱（网址：http://flybase.org/maps/chromosomes/maps.html）进行对照，辨认不同染色体臂，并对3种品系果蝇的唾腺染色体进行比较，重点比较突变基因所在区域的横纹的宽窄、数目、疏密和排列顺序。利用Adobe Photoshop的标尺工具，在同一放大倍数下，测量突变基因所在横纹的宽度及突变基因所在区域的长度，并计算相对宽度。比较突变基因所在区域的横纹的疏密程度时，利用Adobe Photoshop在同一放大倍数下测量突变基因所在横纹与左、右最近2条横纹的距离，求相对距离。突变基因所在横纹距离靠近端粒端（即游离端）的最近一条横纹的距离，简称为距端距离；突变基因所在横纹距离靠近染色中心的最近一条横纹的距离，简称为距心距离。

2 结果与分析

2.1 果蝇幼虫唾腺染色体臂的辨认 辨认果蝇幼虫唾腺染色体臂的最常用方法，是根据染色体臂端粒端的形态特征进行辨认，染色体臂几种常见形态见图1（本文附图见插页1）。在6条臂中，第Ⅳ染色体臂（图 1-o，1-p，1-q）最短，横纹难以看清，形态似乎也在变化，臂充分伸展时可在染色中心附近观察到。5条长臂中，第Ⅰ染色体（X染色体）1条臂，第Ⅱ、第Ⅲ染色体各自2条臂，分别记为 2L、2R 和 3L、3R。

X 染色体臂（图 1-a，1-b，1-c）头部像一个弹头，弹头下方有一个永久性蓬突（图中箭头所指），是辨认X染色体的最突出特征。2L（图1-d，1-e）头部散开呈扇状，端粒端有6条深染横纹，其中如图标示的2、3、4位置上的横纹较宽。对于2R、3L和3R端粒端，笔者均发现有2种形态。2R第1种形态（图1-f，1-g）头部呈圆弧形，末端可清晰看到1条深染的较宽横纹；第2种形态（图1-h）头部呈截断状，末端有1条深染的较细横纹。但2R 2种形态的端粒端均有5条深染横纹（图标1-5横纹），其后有2条浅染横纹（图标6、7横纹）。3L第 1种形态（图 1-i，1-j）头部像一顶僧帽，在帽顶（图标A）有1条细横纹和1条较粗横纹，帽檐（图标B）有1条细横纹，在图标1-6位上固定有6条深染横纹；第2种形态（图1-k）头部呈扇形，在图标1、3、5及6位上为深染横纹，在图标2、4位上为浅染横纹。3R第1种形态（图1-l，1-m）头部呈扇形，第2种形态（图1-n）头部呈截断状，且末端有1条深染横纹。3R 2种形态在图标1处均有1条虚线状的横纹，其后有4条深染横纹，图标2、3和4、5位的横纹分别排列得较紧密。

2R第2种形态与3R第2种形态在光学显微镜下观察十分相似，两者区别：1）3R头部有一虚线状横纹，2R在相应位置上没有。2）2R在图标1、2、3、4位上的横纹排列匀称，横纹之间距离接近，图标5处横纹与图标4处的横纹排列紧凑，而3R在图标2、3及4、5处的横纹形成2对排列紧凑的横纹。

2.2 3种品系果蝇幼虫唾腺染色体臂横纹的比较 18号（图 2-a）、e号（图 2-b）和 6号（图 2-c，2-d）果蝇唾腺染色体都具有染色中心，都由染色中心延伸出6条臂，其中5条长臂和1条短臂。

参照Lefevre绘制的果蝇唾腺染色体臂照片图谱的分区方法[8］，e号果蝇的突变基因 e位于93C7-93D1（图3-a）。比较e号与 18号果蝇93区的横纹数和排列顺序，两者从左到右依次为3条深染带、4条浅染带、2条深染带。由表3～表5可知，e号果蝇突变基因所在横纹的宽度及相对距端、相对距心距离与18号果蝇不存在显著性差异。

6号果蝇的突变基因w、Sn3及m分别位于3B6（图 3-b）、7D1-7D2（图 3-c）、10E1-10E2（图 3-d）。6号与18号果蝇的3区从左至右依次有1条深染带、1条浅染带、1条粗深染带、2条深染带、3条浅染带；7区从左至右依次有4条深染带、2条浅染带、2条深染带；10区从左到右依次有2条深染带、5条浅染带。由表3～表5可知，6号果蝇3个突变基因各自所在横纹的宽度及相对距端、相对距心距离与18号果蝇均无显著差异。

表3 3种品系果蝇突变基因所在横纹的相对宽度的平均值（x±s，*P<0.05）

表4 3种品系果蝇突变基因的相对距端距离的平均值（x±s，*P<0.05）

表5 3种品系果蝇突变基因的相对距心距离的平均值（x±s，*P<0.05）

3 讨论

3.1 果蝇幼虫唾腺染色体臂的辨认 多线染色体横纹的宽窄、数目、排列顺序及疏密程度都具有物种特异性，果蝇不同染色体臂的横纹也各有特色，且染色体臂末端易压散，故通过辨认染色体臂的端粒端确认各染色体是最常用也最便捷的方法。快速掌握此法的技巧是先粗看再细看，先粗略观察端粒端的整体形态，确定可能与之对应的染色体臂，再与照片图谱进行横纹的一一对应，最终确定染色体臂名称。结合照片图谱多练习几次后便能熟练掌握，快速辨认各染色体臂。

果蝇5条长臂的端粒端一般各自有几种不同的形态，但端粒端的横纹特征基本是恒定的，这与杨大翔[9］的结论相同。同一染色体臂末端出现不同形态，可能是受幼虫龄期和压片角度、力度等影响。

在末端模糊不可辨认时，也可从近染色中心处，或选取染色体臂上横纹清晰的具突出特征的2～3个区域，与照片图谱比对，进而确认染色体臂名称。染色体上的蓬突和缢缩是帮助确认的重要特征，可由此2处出发向左或向右选取几个区域进行比对。

3.2 3种品系果蝇幼虫唾腺染色体臂横纹的比较 3种品系黑腹果蝇，体细胞染色体数目为2n=8，18号为野生型果蝇，性状表现为灰体、红眼、长翅、直刚毛；e号为黑檀体果蝇，位于第3对染色体右臂（3R）一对等位基因发生隐性突变，体色性状表现为乌木色、黑亮；6号为三隐性果蝇，即位于X染色体上控制眼色、翅长、刚毛的3对基因发生隐性突变，性状表现为白眼、短小翅、焦刚毛。

实验结果表明，3种品系果蝇幼虫在唾腺染色体横纹的宽窄、数目、排列顺序及疏密程度上不存在明显的差异（图 3、表 3～表 5）。原因：1）少数几个基因的突变不足以引起染色体形态结构的变化。基因是具有遗传效应的DNA片段，DNA分子与蛋白质缠绕形成染色质丝，染色质丝上不同区域发生不同程度的螺旋，聚合成染色粒，上千拷贝的染色粒随着上千染色质丝平行排列而整齐排列，故经染色后呈现出宽窄不一的横纹。基因突变是由碱基对的替换、增添和缺失而形成的基因结构的改变。少数几个碱基对的改变可能并不影响染色粒的形成及染色质丝的排列，故3种品系果蝇幼虫的唾腺染色体在形态上无明显差别。2）3种品系果蝇幼虫唾腺染色体的横纹、疏松区可能在不同龄期幼虫中存在差异，但3龄幼虫时这种差异不存在，是否如此有待进一步研究。3）3种品系果蝇在3龄幼虫的唾腺染色体中可能存在微细差异，但仅通过形态、结构的观察并不能发现，可结合分子生物学技术等进行更深入研究。

4 结论

本文结论主要有以下2点。

1）果蝇唾腺染色体臂端粒端的横纹特征基本恒定，是辨认各染色体臂的最便捷方法。此外，蓬突和缢缩也是辨认多线染色体的重要特征。

2）18号与e号、6号果蝇幼虫，在唾腺染色体横纹的宽窄、数目、排列顺序及疏密程度上不存在明显的差异，在不同变种之间无法区分。