基因组编辑技术及在病毒基因治疗的应用

钟艳君

（上海泰因生物技术有限公司，上海 201400）

基因组编辑技术及在病毒基因治疗的应用

钟艳君

（上海泰因生物技术有限公司，上海 201400）

基因组编辑技术是对基因组进行切割、修饰的一种发展迅速的技术。随着锌指核酸酶（ZFN）、转录激活效应因子核酸酶（TALEN）、CRISPR-Cas9系统三大基因组编辑技术的相继开发，基因组编辑技术得到飞速的发展，在基因治疗方面开辟了一条新的道路。本文综述了基因组编辑技术及在病毒基因疗法的应用现状。

ZFN；TALEN；CRISPR-Cas9；病毒治疗

基因组编辑是一种精确修饰基因的技术，并在近年发展迅速，它可以对基因的多位点及小片段进行融合、突变及删减等，可在基因组水平上进行精确的基因修改。在科研领域，对构建模式动物，可以节约大量人力和财力，在医疗领域，对疾病发病机理和基因功能的探索，可以通过基因组编辑技术更加准确、深入地了解，并且可以改造基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因组编辑技术的发展前景及应用价值非常广泛。随着锌指核酸酶（ZFN）、转录激活效应因子核酸酶（TALEN）、CRISPR-Cas9系统三大基因组编辑技术的相继开发，基因组编辑技术得到飞速的发展和广泛的应用。

1 三大基因编辑技术

1.1 锌指核酸酶ZFN

锌指蛋白最早在非洲爪蟾中发现，是所有后生动物中最常见的DNA序列。锌指蛋白有-个重复结构域，每个结构域由30个氨基酸组成，并具有Cys2-His2，它们通过Zn2+稳定结合形成手指状结构，因此成为“锌指蛋白”。锌指蛋白每个手指上都有三四个碱基，几个手指串联起来就成为具有高度特异性地识别DNA序列，因此，改造锌指蛋白被广泛引用到靶基因的DNA识别中。锌指核酸酶（zinc finger nuclease,ZFN）又称锌指蛋白核酸酶，是一种经过人工改造的核酸内切酶，锌指蛋白作为DNA识别域结合到一个非特异性内切酶上，由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶赋剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。

根据不同的靶序列，需要设计8～10个锌指结构域，将这些锌结构域连在DNA核酸酶上，便可实现靶序列的双链断裂。Kim等利用相对简单的模块化和结构的调整，设计了第一个锌指蛋白核酸酶，该酶使用3个具有公式序列的锌指结构域蛋白与锌指结构域链接一个FokI核酸酶的催化活性功能域，结构表明人工合成的ZFN可以特异性地识别切割靶位点。

1.2 TALEN

TALE（Transcription Activator-like Effector） 由Jens等人在黄单胞菌中发现。转录激活因子（TAL）效应是一种新的DNA几何蛋白，它直接调控宿主的基因表达，在经由细菌递送到宿主细胞中，TAL效应器进入细胞核，绑定在宿主基因启动子特异性效应序列和活化转录。TALEN由一个包含核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。不同类型的TALEN元件识别的特异性 DNA序列长度有很大区别。一般来说，天然的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度一般为17～18bp，而人工TALEN元件识别的特异性DNA序列长度则一般为14～20bp。

1.3 CRISPR-Cas9系统

CRISPR系统结构由一个Cas基因、一个前导序列、一个末端重复序列与CRISPR（捕获的噬菌体或质粒核酸）组成。CRISPR序列能特异性识别外源核酸序列，作为向导RNA；CAS蛋白的非特异性核酸内切酶将外源核酸切断，CAS9蛋白是一个分子质量很大的多功能蛋白，是一条双链DNA酶，有两个独立的结构域，即HNH和RuvC，在剪切DNA链时，分别切割靶DNA的一条链。

在CRISPR-Cas9系统中，酶Cas9在靶点DNA上进行切割。Cas9蛋白催化一种被称作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracr RNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起，形成嵌合RNA（racrRNA/crRNA)，Cas9蛋白在此过程中，起催化作用，促使crRNA成熟。借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对，以这种形式来确定靶基因。这种嵌合RNA接着就能够引导Cas9结合到这个靶点上进行切割，以降解入侵的噬菌体DNA或是外源质粒。

1.4 三大基因编辑技术比较

三大基因编辑技术工都是由两部分组成，即DNA特异性识别结合域和核酸内切酶活性区域。ZNF和TALENS技术都是由一个二聚体与FokI核酸内切酶结构域相结合，而CRISPR-CAS9系统由一个单一的Cas9蛋白与嵌合RNA组成，序列特异性由RNA决定，裂解介导由Cas9蛋白完成。ZNF和TALEN在执行基因编辑前，都需根据靶序列进行设计，ZFN的设计较为困难，因为锌指蛋白与DNA之间的相互作用的复杂性质，以及特异性序列的进一步限制，使得设计良好的ZNF非常昂贵；而TALENS更易设计，因为有蛋白质之间的重复序列和核苷酸序列的一对一的识别规则，以及他们的结构已经能够通过有效的。CRISPR-Cas9更为简单，只需要修改识别RNA，便可识别不同的靶序列。

理论上，ZFN可以针对任何序列，但在实践中，ZFN对非特异性位点的切割的这一现象，会导致细胞毒性和基因毒性，因此ZFN的广泛应用受到了制约。TALENS需要在第一位置有胸苷残基，因此会有所限制，而且有时不能产生预期的突变，因此，每个TALEN都必须经过验证。有研究表明，CRISPR-Cas9在高效靶向DNA编辑功能上，也会出现错配、脱靶切割现象，目前已确认15个脱靶位点，并需继续分析脱靶位点，以减少潜在的脱靶与错配。尽管如此，相对于CRISPR-Cas9系统，ZFN与TALENS有更多的脱靶活动，由此，CRISPR-Cas9系统还是具有绝对的优势。

TALEN和CRISPR都是高效基因组编辑工具，但各有自身限制。TALEN对胞嘧啶甲基化敏感，而CRISPR对甲基化不敏感；TALEN的效率比CRISPR低，但TALEN导致脱靶突变的可能性更低，即使双切口酶、截短了的guide RNAs和Cas9-Fok1融合体可提高CRISPR的特异性。

2 基因组编辑技术在病毒基因治疗的应用

2.1 乙型肝炎病毒（HBV）治疗

乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，可导致肝硬化和肝癌的发生，给全球的人们带来严重的疾病负担，每年的感染人数也十分巨大。尽管现在有抗病毒药物可以控制乙肝病毒，但不能完全清除，需要长期治疗。由此通过彻底消除所有病毒复制中间体，特别是共价闭合环状DNA（cccDNA）成为一个新的治疗方向[1]。2008年，kimberley等人第一个提出通过基因编辑方法来对付乙肝病毒复制。他们设计了6种不同的锌指蛋白（ZFP）锁定乙肝病毒增强子序列，在每个ZFP的存在下，病毒RNA被显著降低，蛋白质水平显著下降，细胞内病毒颗粒也显著降低[2]。2013年，Kristie等人设计了4种TALEN针对病毒基因组内HBV特异性位点，首次证明介导有针对性的核酸酶可以是HBV中cccDNA中断，表明，这些工程化核酸酶具有潜在的治疗慢性HBV感染的用途[3]。世界各地的研究人员通过利用CRISPR-Cas9系统来治疗HBV感染，发现有非常大的可行性。Christoph Seeger等人发现，90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割，并证实CRISPR-Cas9系统在功能上让HBV cccDNA失活，在慢性乙肝治疗上是最好途径[4]。在新研究中，研究人员利用CRISPR-Cas9系统，对感染HBV病毒的哺乳动物肝细胞进行基因组编辑，他们靶向切割了HBV病毒cccDNA中的一些特异性位点，观察到HBV总DNA和cccDNA下降了92%[5]。在相关研究中都表明，CRISPR-Cas9系统可以有效地去除感染者体内的HBV cccDNA，能用于乙肝的治疗[6-7]，是否能在未来体现实际的价值，还有待研究人员的继续探索。

2.2 HIV病毒治疗

另一种至今让人无从下手的病毒就是HIV病毒，作为一种RNA病毒，HIV是一种逆转录病毒。当感染人细胞时，它会将自身的RNA逆转录为DNA后插入宿主基因组中以便复制和合成新的病毒颗粒。CCR5在病毒感染过程中起到重要的作用，ZFN和TALEN都是通过下调CCR5表达量阻断病毒的感染。研究人员利用腺病毒载体携带针对人源CCR5的ZFN在体外敲除HIV-1感染所需的供受体CCR5，通过构建新型的重组核酸酶TALEN并将其靶向内源性的人类CCR5基因是，也同样证实了其可行性[8]。CRISRP/Cas系统则最为直接的切除病毒基因。Ebian等人发现利用CRISPR-Cas9系统，能够破坏HIV-1原病毒，使HIV-1 LTR表达休眠，并能够去除宿主细胞染色体内的病毒基因[9]。利用基因编辑技术首次成功地从活的动物基因组中切除HIV-1 DNA中的一端序列由美国天普大学刘易斯-卡茨医学院的研究人员获得。利用rAAV载体运送系统将CRISPR/Cas9分子运送到动物的血液后，HIV-1的特定DNA片段都被从病毒基因组中切除[10]。这一治疗策略给治疗HIV感染开辟了一条新的道路。

3 结语

基因编辑技术的应用非常广泛，除了疾病的治疗，在建立病毒基因库、特异性位点标记都可以进行基因水平的研究。三大基因编辑技术都对生物研究及医疗领域有潜在的革新意义。为了发掘出这些技术的潜力，仍有许多重要的问题及挑战，如解决错配、脱靶等现象，更快速、高效地进行基因编辑，以及更加深入的了解基因编辑技术都是未来需要研究的。基因组编辑技术在各个领域已占有相当重要的地位，在人类疾病研究中也已有出色的表现，虽然现在仍在研究阶段，但相信通过研究者们的不懈努力，会切实的应用到疾病的常规治疗中，尤其是遗传疾病及病毒治疗。同时，对于现在发病率很高的癌症，是否可以敲除人类的致癌基因，使人们远离癌症，都是值得研究和期望的。

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Genome Editing Technology and its Application in Gene Knockout and Viral Gene Therapy

Zhong Yan-jun
(Shanghai Taiyin Biotechnology Co.,Ltd ,Shanghai 201400)

Gene editing technology is a technology of cutting and modifing the genome,which developed in recent years.With the zinc finger nuclease (ZFN),transcriptional activation of effector nucleases (TALEN) and CRISPRCas9 system,three genome editing technology developed in succession,genome editing technology has been rapid development.Open up a new path for gene therapy.

ZFN;TALEN;CRISPR-Cas9;Gene knockout

Q789

A

2096-0387（2017）05-0095-04

钟艳君（1987—），女，上海人，本科，目前在职攻读上海交通大学生物工程领域工程硕士专业学位，研究方向：生物工程。