蛋白质的提取、分离与纯化研究进展

金秋阳， 刘鑫宇， 胡晶红

(山东中医药大学 药学院,山东 济南 250355)

蛋白质的提取、分离与纯化研究进展

金秋阳， 刘鑫宇， 胡晶红

(山东中医药大学 药学院,山东 济南 250355)

蛋白质的提取、分离与纯化技术是研究蛋白质所必需的，其在生物工程、药物研究、分子研究等领域扮演着越来越重要的角色。随着科学技术的发展，蛋白质的提取、分离与纯化技术也取得了重大发展，本文对蛋白的提取分离纯化方法进行综述，并指出蛋白质分离纯化所面临的问题、解决方法与未来的发展方向。

蛋白质；提取；分离与纯化；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质是一类复杂有机大分子总称，作为生命物质基础，在生命活动中发挥着重要作用。因此，蛋白质是解开人类对于生物体研究的一枚关键钥匙。自1838年荷兰科学家格丽特发现蛋白质，人们就未曾停下对蛋白质研究的脚步。在对蛋白质的研究进程中，蛋白质的提取、分离与纯化是至关重要的一步，是当代生物产业当中的研究热点。但该技术难度大、成本高，所以该技术在实际应用亟需改良和创新。本文对蛋白质的提取、分离提纯方法进行了综述，并阐述了该技术的前景与瓶颈。

1 蛋白质的提取

蛋白质自发现以来，蛋白质的提取就一直备受关注。组成蛋白质的氨基酸成千上万、排列方式多种多样，造成了蛋白质的理化性质不同，因此提取方法也各不一样。纵观当代国内外对于蛋白质提取的研究，普遍采用方法有溶液提取法、酶提取法、超声波提取法和双水相萃取法。

1.1 溶液提取法

蛋白质提取的原理是利用外加溶液使蛋白质变性，形成沉淀析出。因大部分蛋白质均具有水溶性，可溶于水、稀盐等水溶液，在此基础上发展形成了水溶液提取法，它具有安全有效、来源广泛易得等优点，根据原材料性质的不同，提取液用量也各有不同，邱英华等[1]使用碱提法对蚕蛹蛋白进行提取，固液比为1：6时效率最佳。而另有少数与脂类结合的或非极性侧链较多的蛋白质具有脂溶性，可溶于乙醇等有机溶液中，以此为依据建立了有机溶剂提取法，并得到广泛应用，李昊等[2]使用Tripure试剂、乙醇、异丙醇溶液提取到较为纯净的驴皮蛋白。

1.2 酶提取法

酶是一种具有催化作用的大分子，能水解蛋白质多肽链，具有作用温和、高效、专一、多样的特点。与传统的酸碱法相比，酶法可以显著提高蛋白质的提取效率，适用于工业大生产，成为当今蛋白质提取中的常用方法。Morita[3]以大米粉为原料用高温液化淀粉酶提取大米蛋白，提取蛋白含量达90%。沈莲清等[4]采用双酶法(碱性蛋白酶、复合蛋白酶)提取茶渣蛋白，发现碱性蛋白酶对提取率影响较大。

1.3 超声波提取法

超声波提取(超声波萃取)是一种绿色、较为成熟的提取技术，目前被广泛应用于各种动植物蛋白的提取。超声波能够影响原料内部分子的三维结构及活性基团分布，从而影响原料与水的亲和力，增强原料的溶解度；并且超声波能够产生强烈微扰、湍动、空化等效应，增强了蛋白质分子之间的能量传递，使蛋白质分子更好的释放出来。王万能等[5]冰浴超声，提取福寿螺螺肉蛋白，研究表明使用超声波提取量高于未使用超声波,且在超声波提取过程中, 蛋白质提取率曲线随超声时间呈抛物线形式，于33min达到最佳。

1.4 双水相萃取

双水相萃取是在特定前提下亲水性聚合物水溶液形成双水相，根据分离物在两相中分配比不同,实现分离。其特点有含水量高，适于提取水溶性蛋白质；不存在有机溶剂残留；易于放大等。涂绍勇等[6]提取木瓜蛋白酶时以PEG(聚乙二醇)/(NH4)2SO4为双水相系统，在PEG600的百分含量为27%，(NH4)2SO4的百分含量为21%时木瓜蛋白酶的分配系数最高为9.28。目前此技术普遍用于生物化学、生物工程、细胞生物学等学科。

2 蛋白质的分离纯化

蛋白质分离纯化是利用生物工程下游技术从混合物中得到所需蛋白的方法，在蛋白质研究中起到桥梁作用，成为当代生物技术行业的核心。方法多种多样其中根据配体特异性的分离方法为亲和色谱法；依照蛋白质分子大小不同分离的方法有透析与超滤；依照蛋白质带电性质不同进行分离的方法有电泳法、电子交换层析法、沉淀法。

2.1 沉淀法

沉淀法基本原理是溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的不同，宏观上表现为溶解度不同，从而达到分离的目的。影响溶解度大小的因素有溶质和溶剂的化学性质及结构；是否有沉淀剂的加入；溶液pH值、离子强度的改变。目前常用的方法有盐析、等电点沉淀。盐析是利用无机盐溶液来降低蛋白质的溶解度，以使其凝聚析出，具有成本低、高效的优点。 熊利芝等[7]利用盐析、等电点沉淀等多种方法提取栝楼籽蛋白，终得出盐析法效果最好的结论。等电点沉淀在实际应用中常与透析等方法结合使用，张乾元等[8]将等电点沉淀、透析法、乙醇/水脱酚相结合，从厚壳贻贝粉末中分离提取蛋白，得率达93.8%。

2.2 膜分离技术

膜分离技术是指在分子水平上，应用不同粒径的半透膜，对分子大小不同的混合物进行分离的技术。膜分离技术在生物体内即存在，但应用却始于1960年的海水淡化。膜分离技术有以下几个特点：可在分子级、不影响其性质和结构的前提下，对蛋白质分离；工艺简化，运行费用低，节省能源[9]；为物理过程，可使蛋白质保持原有的活性。膜分离技术目前主要有两方面的应用-透析和超滤，杨霞等[10]在提取驴皮蛋白时用蒸馏水透析两天，除去蛋白质中相对分子质量大于一万的杂质，以达到分离纯化蛋白质的目的。周大寨等[11]提取芸豆蛋白时选用切割分子量为5000D的超滤膜，很好地实现了对芸豆蛋白的提取。

2.3 电泳法

电泳法是利用蛋白质为两性化合物的性质，在电场作用下，向两极按各自速率移动，从而使组分分离，得到狭窄的条带，并使用合适的仪器记录电泳区带图谱的方法。现主要有SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳(CE)、双向电泳(2-DE)和等电聚焦电泳(IEF)等

2.3.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

当蛋白质提取后对蛋白质进行分离鉴别，SDS聚丙烯酰胺电泳为常用方法之一，它的基本原理是利用聚丙烯酰胺凝胶网状构造所具有的分子筛效应实现蛋白的分离。由于蛋白质分子量是影响蛋白质迁移率的唯一因素，所以用这种方法测定蛋白质的分子量，操作简便，重现性好，值得进一步推广和利用[12]。

操作中有几点需要注意：在进行电泳时尽量减少染色和脱色时间，盖新娜等[13]实验不经染色直接进行，所得蛋白成分纯度提高，且避免了不必要的成分，证明了此观点。目前实验中常用的脱色液为冰醋酸，但冰醋酸可能会与蛋白质发生反应，从而不利于脱色回收，康彬[14]等的研究证明了该点，且研究出在短暂染色后用250mmol/L氯化钾代替冰醋酸脱色，将蛋白质的回收率提高了三倍多。

2.3.2 毛细管电泳法

毛细管电泳法是上世纪八十年代后在全球迅速崛起的一项技术，因具有分离时间短、分离效率高、系统体积小等优点，毛细管电泳亦成为蛋白质分离分析中的常用手段之一。其基本模式有毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、亲和毛细管电泳(ACE)、毛细管电色谱(CEC)等。在电泳过程中，缓冲液pH值为蛋白质分离的主要影响因素，这是因为pH值不仅控制着样品的有效淌度，还控制着电渗流，pH增大，电渗流加快，组分出峰快，不利于分离[15]。由于在电泳过程中，蛋白质分子中带正电的基团会与毛细管上硅羟基发生不可逆吸附，为提高蛋白质分离效率，应尽可能减少吸附。胡平等[16]在对菟丝子进行电泳时采取了使用减性缓冲液和增大缓冲液离子浓度的措施，有效优化了蛋白质分离条件。

2.3.3 双向电泳

双向电泳为SDS-PAGE与等电聚焦电泳的结合，即先进行等点聚焦电泳(按照等电点分离)，再进行SDS-PAGE(按照分子量大小分离)。双向电泳具有可以在一块凝胶上同时分离数千乃至上万个蛋白质，并可得到每种蛋白质的等电点等信息的优点。在品种鉴别方面，可以作为指纹图谱应用。电泳时蛋白质会因温度过高而畸变，所以最好在进行第二向电泳时安装冷循环水装置[17]；染色方法对电泳结果也有影响，陈蕊红等[18]采用胶体考马斯亮蓝染色法，得到的蛋白质斑点清楚，容易脱色。为了改进双向电泳进一步提高凝胶比对时的准确率，Culu等[19]提出了差异凝胶电泳的新概念，即用荧光标记样品，混合样品后一起电泳，通过不同波长检测荧光，从而在一块凝胶上显示不同样品的差异。

2.3.4 等电聚焦电泳

等电聚焦(IEF)在最近几年急速发展。其优点为重复性好、分辨力高、操作迅速简便。目前等电点相差0.001pH单位的生物分子均可以通过该项技术进行分辨。在实际操作中，影响IEF的最主要因素为毛细管内壁涂层，它可以吸附蛋白质分子，从而影响分离效果，杨春等[20]采用不经稀释的卵清蛋白，以戊二醛为稳定剂，以改良毛细管，获得较好的分离结果。

2.4 层析法

层析法近年广泛应用，基本原理为待分离物质在流动相和固定相中的分配比例有差异，当两个相做相对运动，这些物质在两相中反复分配，使其相互分开，得到较为纯净的目的物质。层析法分支众多，其中高效液相色谱(HPLC)在液相层析中应用最为广泛，本文将着重介绍。

上个世纪60年代，科学人员研究出高效液相色谱法(HPLC)，它将高压泵和化学键合固定相结合用于液相色谱，在当今研究中处于重要的地位。它将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，各成分在柱内被分离后，进入检测器进行检测，从而将样品分离分析，现已广泛应用于蛋白质的研究。

目前应用较广的反相高效液相色谱(RP-HPLC)是HPLC的各种模式中的焦点其通常采用低离子强度的酸性有机洗脱液(如乙腈、二甲基甲酸铵)和烷基硅胶键合固定相[21]。常用的填料有十八烷基、辛烷基等。另外流速、洗脱温度、和洗脱液pH值等因素同样影响蛋白质分离，张丽华等[22]使用十八烷基载体柱分离多肽和蛋白质，实验中提高柱温，不但减少了洗脱时间，还提高了蛋白质混合物的分离效率。实际操作中，多肽种类繁多性质相似，单独使用某种分离方法，可能无法达到理想分离效果， 再加上HPLC 具有无法应用于大生产、浪费资源等缺点，所以HPLC常与其他光谱或色谱联合使用，在这其中HPLC-MS更是被广泛应用，HPLC-MS可以确定蛋白质分子量分布，同时进行自动分离检测，从而提高检测灵敏度，王敏等[23]用HPLC和HPLC-MS分别检测胰蛋白酶中酪氨酸，发现HPLC-MS灵敏度较HPLC显著提高，证实了HPLC-MS灵敏度提高的事实。

2.5 其他

2.5.1 反胶团萃取

用反胶团萃取技术分离纯化蛋白质已引起人们的广泛关注，其实质为液-液萃取，具有可放大和易操作的特点，有广阔的应用前景。这种方法对表面活性剂、离子强度和种类、溶液的pH值、蛋白质的理化性质(亲水性、等电点……)表现敏感。杨邱慧子等[24]利用反胶团萃取红豆蛋白质时发现大多数表面活性剂在己烷、庚烷等脂肪族有机溶剂中较难溶解，无法生成稳固的反胶束体系，不利于蛋白质的分离。虽然当今反胶团技术在理论和应用领域取得重大进展，但仍有很多问题亟待解决，如目标蛋白的提取率和选择性有待提高[25]。在未来，它的众多优点将会吸引更多科学家继续探索。

2.5.2 分子印迹技术

分子印迹技术是在材料化学、结构化学、生物化学等多学科的基础上发展而来的，因其具有预设性、辨别性、可靠性等特点是为近年来新兴的一项技术。基本原理是当模板分子与聚合物分子集合时会在聚合物上留下作用点，从而在聚合过程中将这种作用记录下来，然后当将模板分子分离后，聚合物就会留下相应的凹槽，这些凹槽可以特异识别模板分子或与其相似的物质。包埋印迹法由于简便易行，得到的MIP(分子印记聚合物)性能基本可以令人满意，所以目前被广泛应用[26]，Kazuya[27]在油包水乳液中，利用烷基咪唑作为功能单体,N-α-t-boc-l-histidine作为模板分子制备了有印记效果的胰蛋白酶的模板聚合物。

2.5.3 微流控芯片

随着蛋白质组学的发展，越来越多的科学家将关注焦点转移到了微流控芯片(Microfluidics)上，在芯片上对蛋白质进行分离提纯，分离效率和分离速度都有了明显提高。微流控芯片是一门新兴交叉学科，具有微型化、集成化的特征。满燕[28]着重研究通道内壁简单的涂层技术，从而抑制蛋白质的非特异性吸附。

3 瓶颈

现代技术研究对蛋白质浓度纯度要求极高，但蛋白质分离和提取过程中由于其自身性质或取材原因，使得提出的蛋白质往往无法达到要求。具体问题如下：(1)取材。如驴皮等较硬材料，因胶质和脂肪组织含量较多，杂质干扰严重，提取蛋白质时各提取法效果均不理想。(2)易变性。蛋白质在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等条件下不稳定，蛋白质结构会发生不可逆的变化，从而失去其生理活性。(3)含量低。蛋白质在生物材料中含量较低，而且种类繁多，构成复杂。(4)不稳定性。蛋白质材料易受酶的影响降解而不稳定。

4 展望

随着生物技术水平的进一步提高，对各种蛋白质的结构和功能研究的深入，蛋白质的提取、分离纯化技术也有了飞速发展。蛋白质的研究也不只是只涉及一门单独的学科，而是与化学、物理、药学等学科相联系。虽然目前已有了分子印记技术和微流控芯片等新技术应用到蛋白质的分离纯化，但是由于蛋白质本身性质复杂，不易提取，因此目前还没有适用于所有蛋白质的高效提取分离方法。在未来的研究道路上，如何高效提取蛋白质，提高蛋白质的纯度，将是科学工作者研究的热点。

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(本文文献格式：金秋阳， 刘鑫宇， 胡晶红.蛋白质的提取、分离与纯化研究进展[J].山东化工，2017，46(14)：35-38.)

Research Progress on extraction, separation and purification of protein

JinQiuyang,LiuXinyu,HuJinghong*

(School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Protein extraction, separation and purification technology is necessary for the study of protein, which plays a more and more important role in the field of biological engineering, drug research, molecular research and so on. With the development of science and technology, protein extraction, separation and purification technology has made significant progress. In this paper the methods of extraction, purification and separation of protein were reviewed. The problems, solutions and the future development trend were pointed out about extraction, separation and purification of protein.

protein; extraction; separation and purification; SDS polyacrylamide gel electrophoresis

2017-05-07

山东省重点研发计划项目(2015GSF119004)，山东中医药大学SRT项目(2016060)本研究在山东中医药大学国家级实验教学示范中心平台完成，获得2016年国家级大学生创新创业训练计划项目立项(编号:2016060)

金秋阳(1995—)，女(回族)，山东济南人，本科在读，; 通讯作者：胡晶红(1974—)，博士，讲师 。

TQ936；TQ464.7

A

1008-021X(2017)14-0035-04

专论与综述