秋石斛丛生芽诱导增殖技术研究*

陈齐明鲍晓红高小坤舒婷

（1.福建省鑫闽种业有限公司，福建福清350301；2.福建省林业科学研究院，福建福州350012；3.福建省林业科技试验中心，福建南靖363600）

秋石斛（Dendrobiumhybrida）为兰科（Orchidaccac）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物，其叶四季常绿、其花色彩艳丽且花形优雅，是石斛兰（Dendrobiumspp.）中最具观赏价值的族群[1-2]。秋石斛花期长达1个多月，花序着生于假鳞茎顶端，每个花序着花3~20朵，具有刚强坚毅、祥和可亲的气质，花语为“欢迎您，亲爱的”，被不少国家定为“父亲节之花”，为新加坡、泰国、马来西亚等东南亚国家主要的切花创汇品种[3-4]。我国在改革开放后才陆续引进秋石斛兰，起步较晚，同时由于地域气候的限制，造成秋石斛兰的规模化栽培发展缓慢，以及在育种方面的滞后[5-6]。尤其是在优良品种选育和育种方面，与国外相比还存在很大差距，具有自主知识产权的秋石斛新品种仍然不多。而且我国秋石斛市场上商品种鱼龙混杂，质量参差不齐，栽培的商品种多为杂交一代。通过种子进行播种育苗，子代分化大，无法得到与亲本性状一致的植株。采用分株繁殖，多代后会因病毒的积累造成品种退化[7]。利用植物组织培养方法扩繁秋石斛优良品种，既可以完美保持亲本性状，又可提高秋石斛种苗繁育效率。为加速我国秋石斛产业发展，福建省鑫闽种业有限公司利用秋石斛“三亚阳光”这一优良品种，对其组培扩繁中的丛生芽诱导增殖这一关键环节进行了研究，以期为秋石斛的快速繁殖及其杂交育种后代优良单株扩繁提供技术支持，为后期的秋石斛品种的工厂化组培育苗奠定基础。

1　材料与方法

1.1　试验材料

从福建省鑫闽种业有限公司的秋石斛种质资源收集圃选取“三亚阳光”植株健壮、芽饱满、无病虫害新生侧芽做为外植体材料，低温包装带回实验室。

1.2　试验方法

1.2.1　消毒灭菌

将选取的秋石斛新生侧芽，剥去外面叶鞘，放入饱和洗衣粉水中浸泡并轻轻摇荡30min，再清水冲洗1 h后装入广口瓶中并放置于超净工作台内，用75%酒精消毒30s后无菌水冲洗3次，然后用0.1%升汞消毒15min后，再用无菌水冲洗5次，用消毒过的滤纸吸干外植体表体水分后，将外植体剪成0.8~1cm左右带节小段，接入配置好的诱导培养基。

1.2.2　诱导培养

选用MS、1/2 MS、4/5 MS、B5和WPS作为秋石斛诱导的基本培养基，采用不同浓度的6-BA外源激素与各基本培养基进行组合配置，调整培养基pH值为6.0±0.2，在121℃下灭菌30 min。每个处理20瓶，每瓶接入6个芽，每个处理3个重复。在温度为25±1℃、光强2500±100 Lx，光照时间为12 h·d-1的培养室中培养45d后，调查统计外植体诱导出芽率。

1.2.3　秋石斛芽的增殖培养

采用L9（34）正交试验设计，对秋石斛的增殖培养基进行配制，并根据实际操作中的经验，添适量的加卡拉胶、活性炭、微量元素等改良KC、B5和MS培养基。各基础培养基、激素以及激素浓度的设置如表1所示。然后依据正交设计表的9个处理对秋石斛进行初代培养试验，每处理20瓶，每瓶6个，3个重复。在温度为25±1℃、光强2500±100 Lx，光照时间为12 h·d-1的培养室中培养45d后，调查统计芽的数量，计算芽增殖倍数。

1.3　数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2003和DPS数据处理系统进行数据的统计和处理。

表1　秋石斛增殖培养正交试验因子及水平

表2　秋石斛增殖培养正交试验设计表

2　结果与分析

2.1　秋石斛芽的诱导

切取秋石斛侧芽茎尖接种在以MS为基础的诱导培养基上，培养并连续观察28d。试验结果如表3、4所示，由表6可知当6-BA的浓度在0.1~0.3mg·L-1之间时，随着6-BA的浓度的升高，芽诱导率呈递增趋势，并在0.3 mg·L-1时诱导率达到最高（92.86%），当6-BA浓度超过0.3 mg·L-1并继续增高时，秋石斛芽诱导率开始极显著下降。而且，对各个处理进行多重比较，处理4与其它5个处理间存在极显著差异。因此，秋石斛侧芽茎尖外植体诱导芽时所需6-BA最佳浓度为0.3 mg·L-1。

从表4中可以看出，将6-BA 0.3 mg·L-1分别添加入1/2 MS、4/5 MS和WPS基本培养基中，其中MS基本培养基的诱导率最高达到92.86%，芽体生长良好且在基部产生了大量的愈伤组织，同时愈伤组织上出现了芽点；B5基本培养基的诱导也达到88.33%，但是芽体生长后期缺乏营养，28d后芽体上生长出的叶片会出现黄化现象；1/2 MS、4/5 MS、WPS三种基本培养基对芽的诱导率较之MS基本培养基要低，诱导率在52.71~78.96%之间，且芽体在这三种基本培养基上长势均较MS培养基要弱，愈伤组织产生也相对较少。因此，秋石斛茎段进行芽诱导时应选择MS培养基作为基本培养基。

表3　不同浓度的6-BA对芽诱导的影响

表4　不同的培养基对芽诱导的影响

2.2　不同培养基配比下秋石斛的增殖情况

采用正交设计试验研究了3种基本培养基以及6-BA、NAA、葡萄糖等4种因素对秋石斛侧芽诱导增殖的影响，由表5、表6可知，当培养基和外源激素配比情况相同时，秋石斛侧芽的增殖系数差异不显著（P=0.6608＞0.05），而不同培养基以及不同激素浓度配比情况下，秋石斛侧芽的诱导增殖系数存在着极显著差异（P=0.0001＜0.01）。9个处理组中除第5组的诱导增殖系数为2.50外，其它8个组的诱导增殖系数均超过了3，其中第8处理组的诱导增殖系数高达8.15，极显著高于其它9个处理组。说明采用秋石斛的侧芽进行诱导增殖是可行的，但要想取得较高的增殖系数，需要进一步对培养基进行合理的调整和配比。

正交试验结果（表7）表明，基本培养基、6-BA浓度、NAA浓度、葡萄糖浓度的R值分别为3.9633、0.8466、0.9727和0.5614，即这4个因素对秋石斛继代增殖的影响力的大小顺序为：基本培养基＞NAA浓度＞6-BA浓度＞葡萄糖浓度。这说明秋石斛侧芽增殖起主要作用的是基本培养基，其次是NAA浓度，而葡萄糖浓度对增殖的影响相对最小。秋石斛芽诱导的最佳处理组合为A3B1C1D3，即采用改良MS+6-BA 0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+葡萄糖30g·L-1作为秋石斛的继代增殖培养基，能获得最高的增殖系数。

表5　不同培养基配方下秋石斛增殖系数方差分析及显著性检验

表6　不同培养基配方下秋石斛增殖情况分析

表7　秋石斛增殖培养正交试验结果

3　小结与讨论

采用秋石斛的新生侧芽为外植体培养秋石斛组培苗，结果表明：秋石斛侧芽茎尖的最佳诱导培养基配方为MS+6-BA 0.3mg·L-1，诱导率高达92.86%，外植体基部产生了大量的愈伤组织，同时愈伤组织上出现了芽点，芽点陆续发育成芽体粗壮，伸长明显的不定芽，芽体的茎段的节间陆续冒出叶芽发育成叶，叶片浓绿，生长较好。秋石斛继代增殖培养过程中，不同培养基配方下秋石斛的增殖系数存在极显著差异，而同种配方下秋石斛的增殖系数不显著。基本培养基、6-BA浓度、NAA浓度、葡萄糖浓度均会影响到秋石斛的增殖系数，其中对秋石斛诱导增殖的影响最大的为基本培养基种类。秋石斛最佳培养基配方为改良MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+葡萄糖30g·L-1，秋石斛继代增殖系数可达8.15倍。采用其它培养基配方，继代增殖系数变化很大，从2.50~7.03不等。

培养基种类和生长调节剂种类与浓度、营养添加物的种类与浓度均影响着秋石斛的诱导与增殖，这些因子间又存在相互作用的关系。在生产实践中，为克服秋石斛组织培养过程中褐化现象的发生，还会在培养基中添加抗褐化剂，而抗褐化剂的添加会在一定程度上影响最佳增殖培养基增殖效果的发挥。因此，从试验得出的最佳培养基配方，应用到生产实践，还需进一步探索秋石斛组培育苗过程中的各种因素的平衡点，使秋石斛在实现诱导率最高的同时，能顺利进入继代增殖环节获得最高的增殖系数，进入生根培养环节能获得生根较好、个体壮实的组培苗，同时还能兼顾育苗成本，实现秋石斛组培育苗的效益最大化。

参考文献：

[1]中国林业科学研究院花卉研究与开发中心.石斛兰[M].北京：中国林业出版社，2007.

[2]丁灵，李崇晖，尹俊梅，七种秋石斛鲜花挥发性成分差异性分析[J].广西植物，2016，36（3）：361-368.

[3]陆顺教，易双双，任羽，等.秋石斛新生侧芽中部茎段组培快繁体系的建立[J].南方农业学报，2015，46（8）：1436-1441.

[4]张蝶.蔗糖和磷酸氢二钾对秋石斛切花花瓣衰老进程的影响[D].武汉：华中农业大学，2011.

[5]卢思聪.热带洋兰秋石斛（上）[J].中国花卉盆景，2003（9）：4-5.

[6]邬秉左.石斛兰的品种及栽培[J].花木盆景，2002（3）：14-15.

[7]罗岚，关仕港，刘建昌，等.秋石解兰离体快速繁殖研究[J].佛山科学技术学院学报（自然科学版），2004，22（2）：69-71.