啤酒发酵过程中酵母环境压力应答机制研究进展

王金晶，杨静静，丁华建，郑梅莹，李崎*

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡,214122) 2 (江南大学 酿酒科学与工程研究室,江苏 无锡,214122)

啤酒发酵过程中酵母环境压力应答机制研究进展

王金晶1,2，杨静静1,2，丁华建1,2，郑梅莹1,2，李崎1,2*

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡,214122) 2 (江南大学 酿酒科学与工程研究室,江苏 无锡,214122)

在啤酒发酵过程中，生产高质量的啤酒要求相应的工艺条件以保证啤酒的质量以及酵母的活力。大多数的风味物质都是在后熟的过程中形成，在后熟过程中，啤酒酵母暴露在不同的压力条件下，包括渗透压、pH、酒精浓度、营养以及温度等。在长期的驯化过程中，啤酒酵母自身表现出各种压力应答机制以适应啤酒发酵过程。本论文概述了啤酒发酵过程中啤酒酵母受到的压力，重点探讨了啤酒酵母在后酵期经受的压力以及压力应答的分子机制，并对如何提高啤酒酵母环境压力应答能力进行了展望。

啤酒发酵; 酵母; 环境压力; 全局应答系统

啤酒酵母是啤酒酿造的灵魂，啤酒的风味主要由啤酒酵母代谢产生的风味物质综合形成，啤酒酵母的质量控制决定了啤酒的质量。现代啤酒高浓度酿造的工业发酵条件给酵母不同于实验室培养的条件，造成啤酒酵母自溶的压力贯穿了整个啤酒酿造过程，主要包括发酵初期的高糖、高渗透压，发酵过程中的氧化压力，以及发酵后期尤其是后酵期来自于酒精的毒性和营养缺乏的压力[1]。当酵母细胞感受到压力或者对细胞来说产生一种毒性刺激而无法抵御时，细胞开始自我降解。研究指出，当超过5%酵母发生自溶时，啤酒质量将发生不可挽回的破坏。啤酒酵母(Saccharomycespastorianus)自溶将会给啤酒的风味、品质带来重大影响，包括影响啤酒风味，影响啤酒胶体稳定性，影响泡沫性能以及引起微生物污染等[2-4]。因此，在啤酒生产过程中，不希望发生酵母自溶或希望尽量的减少发生酵母自溶。

啤酒酵母作为啤酒酿造的重要因素，其环境压力应答对啤酒发酵过程的正常进行有着举足轻重的作用。本文综述了啤酒酵母在发酵过程中的环境压力应答以及相关的应答机制，以期为提高啤酒品质提供理论依据和参考。

1 啤酒酵母抗氧化应力应答

尽管酵母属于兼性厌氧微生物，在啤酒发酵过程中，氧气仍然对啤酒酵母的代谢起到非常重要的作用。在发酵初期通氧是必须的，充足的氧气能够保证酵母的生长，同时也保障了细胞膜脂类的合成，以及甾醇和不饱和脂肪酸的合成[1]。但是氧气的存在也是造成酵母以及啤酒老化的最主要原因，其中最主要的因素即活性氧自由基(ROS)[5]。

啤酒中老化物质的形成机理复杂，老化物质种类繁多。啤酒酵母代谢过程中所形成的内源性抗氧化物质对啤酒的风味稳定性具有重要作用。不同的啤酒酵母菌株的抗氧化能力取决于其细胞内的抗氧化分子的多少，这些抗氧化分子包括了一些非酶分子如谷胱甘肽(GSH)、金属硫蛋白、海藻糖、泛醌、麦角固醇和酶分子如过氧化氢酶、细胞色素c过氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷氧还蛋白、谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶等[1]。不论是在实验室小规模发酵或者工业生产过程中都发现了啤酒酵母能够在氧化压力下非常迅速的应答环境压力。CLARKSON等人[6]发现在发酵过程中加氧或除氧会造成胞内锰超氧化物歧化酶以及过氧化物酶活力的变化。WALKER等[7]人报道随着酵母接种的进行，过氧化物酶活性提高。GSH作为一种非常出色的抗氧化剂，其在氧胁迫下的生物合成机制一直是研究人员关注的热点。GIBSON等人[1]发现在发酵过程中酿酒酵母胞内GSH含量受氧浓度调控。GSH由GSH1和GSH2基因催化合成，研究发现，酵母的GSH的合成与二氧化硫、硫化氢合成途径密切相关。通过对啤酒酵母GSH合成过程中GSH1基因的调控，发现在啤酒酵母中过表达GSH1基因能够提高啤酒酵母的GSH合成量，提高啤酒酵母的抗氧化能力[8-9]。在啤酒发酵后期，酵母细胞中抗氧化基因转录增加，使抗氧化物质得到积累以抵抗氧自由基对酵母带来的压力[10]。研究发现，啤酒发酵后期，啤酒酵母中与抗氧化压力相关的途径中，谷胱甘肽合成途径中GPX1，GRX6，GSH1，GLR1几个重要基因的表达量明显上调；超氧游离基消除途径中SOD1，CTT1，CTA1基因发生了明显上调，仅有SOD2基因水平发生轻微下调；其他抗氧化压力相关基因PRX1，SNT2，ERV1，YAP1，YRR1，AFT2都发生了不同程度的上调[11-12]。

海藻糖是一类非常重要的压力保护剂，在酵母中含量非常高，可达到细胞干重20%以上。海藻糖的抗氧化压力主要体现在其保护细胞组分免受ROS破坏。研究发现，与海藻糖合成TPS1、TPS2、TSL1、TPS3)与降解(NTH1、NTH2、ATH1)相关的基因受STRE元件的调控[13-14]。在酵母自溶过程中，与海藻糖降解相关基因ATH1和NTH1的表达水平发生了相应的下调，使海藻糖降解速度减慢，从而保证了海藻糖在啤酒酵母细胞中的积累，保护细胞不受发酵液中的氧自由基侵袭[15]。当细胞缺乏锌指转运激活因子Msn2p和Msn4p时，细胞将无法合成海藻糖。另外，在发酵后期，缺氧条件下控制酵母细胞壁合成相关的基因如CWP1和CWP2表达上调，以应答缺氧条件的环境压力[1]。

2 啤酒酵母抗渗透压力应答

对啤酒酵母而言，渗透压力贯穿整个发酵过程，从发酵起始的高浓度糖至发酵后期的高浓度酒精都给啤酒酵母带来一定的渗透压力。现代啤酒工业生产中的高浓酿造技术要求啤酒酵母具有较好的抗渗透压能力。而酵母的渗透压调节能力可以分为自身具有的物理抗渗透能力以及长期适应环境形成的适应性抗渗透能力。啤酒酵母的物理抗渗透能力因菌株而异，并且稳定期细胞抗渗透能力较对数期好[1]。啤酒发酵后期，酵母处在一个低糖高酒精环境中，来自酒精的压力为细胞造成了一定的渗透压力。研究表明，酵母细胞壁的结构组成会影响细胞的抗渗透能力，增加细胞壁中葡聚糖、甘露聚糖含量能够有效提高酵母的抗渗透压能力[16-17]。BURATTINI及CAVAGANA等人发现酵母葡聚糖的代谢与细胞壁增厚存在一定的关联性[18-19]。葡聚糖合成酶包括两个亚单元，分别膜结合催化亚基以及GTP结合调节亚基，其中FKS1、FKS2和FKS3基因被认为是催化亚基的编码基因，而RHO1、ROM2、WSC3、WTL1、LRE1、ZDS1等基因则属于调节亚基的编码基因[20]。在啤酒酵母的选育过程中，我们基于啤酒酵母细胞壁组成的特点，通过紫外诱变筛选获得的酵母采用压力抗性平板复筛，最终获得了抗压能力明显提高的啤酒酵母菌株。分析该啤酒酵母诱变菌株的细胞壁成分，发现其葡聚糖含量是出发菌株的1.5倍以上，甘露聚糖含量也有了一定量的提高，其总多糖的含量比出发菌株提高了近49%。酵母细胞壁多糖的含量的增加有效地提高了啤酒酵母对外界渗透压的抗逆能力[21]。

酵母细胞中存在着多种信号传递系统，其中由蛋白激酶C(Pkc1p)介导的MAPK级联系统在维持细胞壁完整性方面起着重要的作用，因此被称为酵母细胞壁完整性(CWI)信号途径。MAPK级联系统的核心是由蛋白激酶C的磷酸化触发了下游一系列的磷酸化过程，使该系统处于激活态，进而介导细胞内一系列生物学变化。CWI途径为酵母细胞提供一种加强和修复细胞壁损伤以抵御环境压力的方式。在细胞中表达的Mid2p、Wsc1p、Mtl1p等感应因子感受到环境压力变化后会将信号传递给Rom2p，然后至Rho1p，Rho1p激活Pkc1蛋白激酶，由Pkc1再激活MAPK模块；同时，Pkc1p使Bck1p磷酸化并将信号传导给Mkk1和Mkk2p，进一步激活Slt2/Mpk1[22]。CWI途径作为细胞中最重要的应激反应途径之一，其感知因子WSC1、MID2及MTL1在啤酒酵母感受到压力过程中表达发生下调，而其他基因如BCK1、RLM1及SKN7等则发生了不同程度的上调，进而引起酵母细胞的应激反应[15]。

适应性抗渗透能力来自于对环境的适应，尤其明显的是细胞的大小。当渗透压增大时，酵母细胞迅速的变小，而当压力消失之后，细胞会逐渐恢复原来的大小。LEVIN等人发现这一现象与HOG1/MAP激酶途径相关，细胞壁上的Wsc1p感受到压力时，HOG途径中的相关酶被激活，调整细胞壁的流动性以改变细胞的大小。在啤酒酵母的自溶过程中，HOG途径中SLN1，HKR1，MSB2，YPD1，SSK1，SSK2/22，PBS2，STE50基因表达发生明显上调，表明啤酒酵母在自溶过程中细胞抗渗透压力能力被激活[12]。在酵母细胞膜上存在一个水通道蛋白，是跨膜蛋白家族中主要内在蛋白(MIP)中最大的一个蛋白，它还包含了质膜内在蛋白(PIPs)和液泡膜内在蛋白(TIPs)。而水通道蛋白编码基因AQY1和AQY2与酵母细胞的适应性抗渗透压能力有着非常密切的关系[23]。近期研究发现在某些啤酒酵母中AQY2基因并没有功能，而只需要有AQY1基因即可以执行水通道蛋白功能。适应性抗渗透压能力的获得对啤酒酵母酿造后期适应发酵环境提供了便利。

3 酵母抗酒精毒性压力应答

在啤酒酿造过程中，麦汁中的酒精浓度不断升高，对酵母来说就是暴露在毒性越来越强的酒精溶液中。在正常的发酵情况下，发酵结束时，酒精浓度大约在3%～6%，但是在高浓酿造中，发酵结束时酒精的浓度会达到10%以上[24]。现今，因高浓度酿造具有提高啤酒产量、减少能耗、降低成本的独特优势，而成为啤酒酿造中一种标准的酿造方法，。有报道称高浓酿造生产的啤酒有更好的风味和稳定性[25]。然而高浓酿造很大程度是建立在损害啤酒酵母本身的生理状态和后续发酵性能的基础上的。在现代高浓酿造生产中，发酵结束时酒精浓度可高达16% vol，远远超过了12 P麦汁发酵产生的3%～6% vol的酒精度，由此导致细胞活力减弱，后续发酵能力降低。

酒精对酵母细胞膜的破坏最严重，其中主要的影响包括限制细胞的生长，限制细胞的大小，使细胞活力下降，呼吸能力下降，葡萄糖同化能力减弱，发酵性能下降，脂肪的改造，质子穿膜能力的丧失，膜的通透性增加，膜内pH值下降等[26]。有许多研究报道指出酵母细胞膜的变化是细胞酒精耐受的重要原因。酵母细胞通过增加膜的不饱和度以增加其流动性来抵抗酒精浓度的提高。研究发现，油酸是抵制酒精最重要的脂肪酸之一。酿酒酵母质膜中最主要的游离脂肪酸是软脂酸(C16∶1)和油酸(C18∶1)，是由两者各自的饱和脂肪酸分别去饱和化所形成的。该反应由去饱和酶(OLE1基因编码)催化进行，在发酵过程中OLE1基因表达上调使不饱的脂肪酸含量增加，增加了细胞膜的流动性[27]。近年来的研究进一步证明了油酸(C18∶1)是酵母能够抑抗酒精毒性的主要因素之一[28]。这种不饱和脂肪酸含量上升、相应的饱和脂肪酸含量下降，同时发生在上面发酵酵母和下面发酵酵母中。但是，是否仅因为膜的脂肪酸组成发生了变化使酒精耐受性提高而导致发酵性能的提高，或者仅因为营养条件的改善而导致发酵性能提高还无从论证。另外，有研究指出海藻糖的积累与酒精耐受机制也有一定的联系，ALEXANDRE等[29]报道将酵母细胞置于酒精浓度为7%的压力环境下，海藻糖合成基因表达将会上调。

通过转录组学分析发现在发酵后期，一些抗氧化相关的基因表达水平上调。JAMES等发现在啤酒发酵过程中，发酵3 d或8 d后，不管是否处于无氧状态，有9个与抗氧化相关的基因表达上调。但是，这种抗氧化基因的表达上调是由于其它的压力存在或者是直接暴露于酒精的压力下所造成的还不明确[27, 30]。将酵母暴露在7%的酒精中30分钟后发现CTT1基因的表达量增加了12倍[29, 31]。

4 啤酒酵母抗饥饿压力应答

麦汁是一个复杂的生长环境，主要包含碳水化合物(90%麦汁固形物)和含氮物质(5%麦汁固形物)，还有一部分磷酸盐、无机离子、脂类、有机酸、多酚和核酸衍生物。啤酒酵母对可发酵糖和可利用氮源耗尽的反应就是进入稳定期。进入稳定期后，酵母不再经历复制而停留在G0期，进入沉默期。沉默是细胞对抗营养消耗的一种普遍的现象。

细胞的沉默机制可以在营养缺乏的状态下保护细胞。这种胁迫应答途径通常包括细胞分裂停止，细胞壁增厚，细胞的孔洞减少，细胞壁甘露聚糖蛋白结构变化以增加对抗裂解酶的能力，胞内蛋白酶积累，液泡中多磷酸盐积累，贮存性碳水化合物增加，以及抗压力性能加强[31-32]。这些改变使沉默期的细胞对外界的环境变化敏感性降低，以保证细胞能够在营养不足的情况下抵御某些特定的压力。随着营养物质的消耗，细胞进入到稳定期时，胞内糖元和海藻糖的含量也发生了相应的变化。研究发现，在发酵后期，控制糖元以及海藻糖合成的基因表达水平明显上调[33-34]。由于氮缺乏会诱导酵母细胞的全局应答即GSR现象，因此推测海藻糖的积累和降解是一个压力应答单元(STRE)介导的氮源缺乏应答途径。另外，海藻糖也有调节糖酵解的作用。研究证实海藻糖-6-磷酸抑制己糖激酶的活性，限制了糖酵解途径中糖的同化作用，在发酵起始调控中具有重要的用，而这个途径具体的调控机制至今也没有研究。

5 酵母的全局压力应答系统

现代啤酒发酵过程中，酵母是通过压力泵送到发酵罐中的，在发酵过程中需要经历一系列的环境压力变化。面对这一系列不同的压力，酵母具有一套完整的压力应答系统，各个代谢途径相互协调统一，并具有相对的稳定性，无论是分解代谢还是合成代谢，均能做到既不过量，也不缺少。当外界条件发生变化并足以对细胞产生影响时，这套灵敏、可塑性强和精确性高的自我代谢调节系统就会适时作出调控，从而保证细胞极其复杂的生化反应能准确无误、有条不紊地进行。这种调控常表现为多水平的协同作用，即称为全局应答系统(GSR)。

GSR可被一系列环境因素激活，包括氧化、pH、热力、渗透压以及氮饥饿。GSR被认为是一种抗逆机制，从进化角度来看，这种应答机制允许酵母适应不良环境，以保持繁殖能力。受到压力胁迫时，GSR机制被激活，大约200个基因的表达上调，同时相应的蛋白表达量也增加，参与到相应的细胞应答途径中[1]。这些基因的表达是依赖于被诱导基因的启动区中CCCCT基因序列来启动的，这些序列被称为是压力应答单元(STRE)，它首先是在压力诱导细胞质过氧化氢酶编码基因CTT1的表达及其伴侣蛋白编码基因DDR2的表达中被发现的[35]。后续研究发现与STRE单元的激活、相关的基因诱导与两个锌指转运激活因子(Msn2p和Msn4p)相关[36-37]，在一系列压力条件下会被激活。GSR是一个短暂的过程，在压力消失后，Msn2p会被快速降解，所表达的蛋白也会逐渐被降解对细胞的基因转录水平变化的研究近年来被广泛应用于酵母应对各种环境压力的耐受性机制研究中。同时，自2009年NAKAO等人完成了第一株啤酒酵母(S.pastorianus)的全基因组测序工作[38]之后，明确了工业啤酒酵母的来源，为进一步研究啤酒酵母分子机制提供了方便。基于基因组序列的microarray研究发现了许多工业啤酒酵母存在独特的抗逆机制。通过传统育种方式，SANCHEZ等人将上面发酵酵母的基因与下面发酵酵母的基因进行了融合，获得了1株耐高温、高渗透压等压力因素的新型工业啤酒酵母菌株[32]。

6 结语

我国作为啤酒生产大国，2014年统计结果显示中国的啤酒产量首次出现了下划趋势，并且这一趋势在这一两年内持续发生，在这个产量已无法主导市场利润的特殊时代，啤酒的质量成为制约企业行业发展的重要因素，而啤酒酵母的质量直接影响着啤酒的质量。了解啤酒酵母压力应答机制，从源头控制酵母质量，提高酵母抗压能力，有效解决国内啤酒行业酵母使用代数少，生产成本高的问题。

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Research progress in yeast global stress response during beer brewing

WANG Jin-jing1,2, YANG Jing-jing1,2, DING Hua-jian1,2,ZHENG Mei-ying1,2,LI Qi1,2*

1 (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2 (Lab of Brewing Science and Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In beer brewing, production of beer with high quality requires relative producing techniques to ensure the quality of beer and the yeast. Most of the flavor compounds are produced during post fermentation process, wherein brewer’s yeasts are exposed to various kinds of stress such as osmotic pressure, pH, alcohol, nutrition and temperature. In the process of long term domestication, brewer’s yeasts have developed different stress response mechanisms to adapt the beer brewing process. The different stresses experienced by brewer’s yeast during beer brewing especially the post fermentation process are reviewed in this paper, and the stress response mechanisms of brewer’s yeast are discussed. Meantime, the methods for improving the stress response ability of brewer’s yeast are discussed.

beer brewing; brewer’s yeast; global stress; global stress response

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701044

博士，副教授(李崎教授为通讯作者,E-mail：liqi@jiangnan.edu.cn)。

国家自然科学基金(31301539)；国家自然科学基金(31271919)；国家自然科学基金(31571942)

2016-07-08，改回日期：2016-08-04