18种大豆多酚含量组成及抗氧化活性分析

朱怡霖，张海生，杨淑芳，赵鑫帅，薛焕焕

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

18种大豆多酚含量组成及抗氧化活性分析

朱怡霖，张海生*，杨淑芳，赵鑫帅，薛焕焕

(陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

分析18种大豆品种的总酚含量、多酚的组成及抗氧化能力。以榆林和山西地区的大豆为试材，Folin-Ciocalteau 法测定总酚含量，高效液相色谱法(HPLC)测定多酚组成成分，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)和铁还原抗氧化力(ferric reducing-antioxidant power, FRAP)法测定抗氧化能力，相关系数法分析抗氧化能力与多酚含量的相关性。18种大豆品种之间总酚含量存在明显差异，靖边黑豆品种含量最高，达到5.07 mg/g，HPLC 鉴定出没食子酸、原儿茶酚、绿原酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素和肉桂酸等9种多酚组成成分，其中原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸的含量较高，且这些组分含量及总酚含量之间存在差异，DPPH和FRAP抗氧化能力之间也存在明显差异；大豆的总抗氧化能力与其总酚、原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸含量之间呈现极显著的正相关性(P<0.01)。

大豆；总酚含量；酚类化合物；抗氧化

豆类是中国传统的药食兼用的农产品资源之一，不仅含有大量蛋白质、脂肪、氨基酸、微量元素及维生素，而且还含有黄酮类及酚类物质，这2种物质均对自由基有清除能力，是天然的抗氧化食品[1-2]。

近几年，随着研究的越来越深入，整本书阅读，或者说书册阅读，在实践上也开始了探索。2007年，扬州市语文特级教师岳乃红在所著的《班级读书会ABC》一书，结合一线教学实践，总结了一套以“班级读书会”的形式来进行整本书的阅读的方式，她提出了以“班级读书会”的形式来组织“整本书”阅读教学过程，并在此过程中对学生进行“整本书”阅读指导的策略。

天然多酚类化合物是植物体内重要的功能性化合物，主要由酚酸、黄酮和单宁类物质组成。酚类化合物具有良好的清除自由基、抗氧化、抑制脂质过氧化等作用，是潜在的高效天然抗氧化剂[3-5]。XU[6]和TAKAHASHI[7]等研究表明，黑豆和黄豆中含有大量的多酚类化合物，而且还具有较高的抗氧化活性。目前，关于大豆多酚的研究仅限于测定其总含量，对其多酚单体的组成及含量鲜见报道[6]。为了清楚的了解大豆种子的多酚构成情况及生理活性，开发出多酚总含量和某单体含量较高、保健作用较强的大豆品种，有必要对其抗氧化活性、单体组成及含量进行分析。

本文采用HPLC 对大豆品种中多酚组成及各单体含量进行分析。总酚的抗氧化活性通过DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除率能力和总抗氧化能力FRAP(ferric reducing-antioxidant power，铁还原抗氧化力)进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

成联方:书法的专业教学，是非常重视创作能力培养的，也非常重视书法文化知识的传授。本科和硕士、博士等三个阶段的教学重点有所不同。一般来说，本科更重视技法教学，硕士大概技法与研究各占一半，博士基本都是史论研究。大体是这样，但各院校之间有些差异。基础厚实、历史悠久的学校做得好一些，年轻的学校、师资欠缺的学校做得差一些。书法界经常开展高校书法教育论坛，讨论高等书法教育问题。应该说，整个高校书法教育是向良好的方向发展的。

Airbnb联合创始人中国区主席Nathan Blecharczyk曾透露，目前中国区的房源已经达到15万套，自2008年以来已经有1000万中国游客选择了Airbnb，中国极有可能在2020年成为Airbnb的最大客源国。随着用户习惯养成、服务标准化完善、制度与政策环境优化等，Airbnb在中国区接待的游客数量也在逐年上升，这也对Airbnb的民宿服务有了更高要求。

试剂 ：没食子酸，原儿茶酸，绿原酸，对羟基苯甲酸，咖啡酸，对香豆酸，阿魏酸，槲皮素，肉桂酸，三吡啶三吖嗪(2,4,6-tripyridyl-s-triazine,TPTZ), 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl,DPPH)，水溶性VE(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid ,Trolox)均购自Sigma 公司，其他试剂均为国产。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

取各参试大豆粉碎过60目筛，准确称取1.0 g，加入10mL石油醚振荡脱脂24 h，用15 mL体积分数80%的甲醇于超声提取仪40 ℃提取30 min后，3 000 r/min离心15 min后收集上清液，残渣以同样方法重复提取2次，合并3次提取液，40 ℃旋转蒸发后用甲醇定容至10 mL，于4 ℃冰箱中备用。

3.2 大豆种子的抗氧化活性与多酚和黄酮含量的关系

[8]的方法并稍加改进。采用Folin-Ciocalteau 法测定总酚含量，准确移取各提取液0.1 mL，分别加入0.5 mL蒸馏水和0.1 mL Folin-Ciocalteu 试剂，3 min后加入7.5 g/100mL Na2CO3溶液0.3 mL，于漩涡混合器中混合，置于25 ℃水浴避光反应2 h，以0.1 mL蒸馏水代替样品做空白，在760 nm波长处用酶标仪测定吸光度A。以没食子酸作标准品代替样品作标准曲线，得到回归方程y=0.005 1x+0.003，R2=0.999 3。样品中的总酚以没食子酸的含量表示(mg/g)。

1.2.3 总黄酮含量的测定

参考文献[9]的方法稍加改进。采用Al(NO3)3络合分光光度法测定总黄酮的含量，准确移取各提取液1 mL,分别加入质量分数5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min，分别加入质量分数10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，放置6 min，再加入质量分数4% NaOH溶液10 mL，用体积分烽80%甲醇定容至25 mL，摇匀，放置15 min，在506 nm波长处用酶标仪测定吸光度A。以芦丁作标准品代替样品作标准曲线，得到回归方程y=0.005 7x+0.004 6，R2=0.996 2。样品中的总酚以芦丁的含量表示，单位为mg/g。

1.2.4 酚类化合物的组成

采用HPLC法测定酚类化合物的组成[10]。取上述处理过的各样品提取液1 mL，0.45 μm滤膜过滤。采用Thermo U-3000 HPLC 系统，Diamonsil C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)和质量分数1%冰乙酸(B)溶液，检测波长 280 nm，柱温 30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量 20 μL，HPLC的总运行时间为50 min。梯度洗脱条件：0～5 min，5%～15% A；5～35 min，15%～35% A；35～40 min， 35%～45% A；40～50 min， 45%～5% A。样品的定性与定量通过与标品的出峰时间和峰面积来确定。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1,1-二苯基苦基苯肼)自由基清除率的测定，参照文献[11]和[12]的方法进行，准确移取适当稀释的各提取液0.2 mL于试管中，加入0.2 mmol DPPH溶液3.8 mL，再用蒸馏水定容至10 mL，常温下避光反应30 min后517 nm波长处用ELIASA测定吸光值。以乙醇作对照，DPPH自由基清除能力以mg Trolox标准物质/g豆类干物质表示(mg TE/g)。

1.2.6 总抗氧化能力的测定(FRAP法)

FRAP(ferric reducing-antioxidant power，铁还原抗氧化力)法测定抗氧化能力，参照文献[13]和[14]的方法进行，取适当稀释的各提取液0.01 mL，加入0.36 mL TPTZ工作液(由300 mmol/L pH 3.6的醋酸盐缓冲液25 mL，10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL，20 mmoL FeCl3溶液2.5 mL 组成)，混合后避光37℃反应10 min，593 nm ELIASA测定吸光值，以Trolox 为标物计算抗氧化活性(FRAP 值，单位mg TE/g)。

1.3 数据统计分析

采用 SPSS 17.0 软件(SPSSInc, Chicago, IL, USA)进行统计分析，数据结果以平均数±标准差(n=3)表示，采用Duncan多元回归方法分析0.05水平上均值的显著性差异。选用Pearson 相关系数分析相关性。

2 结果与分析

2.1 不同大豆种子资源的总酚和总黄酮含量

采用Folin-Ciocalteu 法和硝酸铝络合分光光度法分别对18种大豆的总酚含量和总黄酮含量进行测定结果见表1。

注：表1结果表示为3次测定的平均值±标准差；不同的小写字母表示在0.05显著性水平上差异显著。表3同。

18种大豆种子中的总酚和总黄酮存在显著性的差异。靖边黑豆的总酚含量最高5.07 mg/g,吉育82品种的总酚含量最低2.07 mg/g。 定边小黑豆的总黄酮含量最高0.90 mg/g，神木鸡腰白、横山狗牙豆和汾豆79品种的总黄酮含量较低。BAOJUN等[6]研究报道，黑豆的总酚及黄酮含量比黄豆的含量高，本研究结果与其一致。同时本研究结果比李思获等[14]报道结果所得的多酚含量高，总黄酮含量低，这可能与研究的品种，种植条件和地区，原料预处理方法以及分析条件的不同有关。

2.2 多酚的组成

HPLC共鉴定出没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和槲皮素等9种酚类物质，标准品图和样品图分别见图1和图2，定量结果见表2。

(二)以危机为契机传递中国在南海问题上的利益诉求、政策意图与维权决心。中国出于周边外交整体战略的考虑在南海问题上长期以来相对克制，各声索国却肆无忌惮地巩固非法强占的既得利益。因此，南海问题的最终解决还需要中国进一步明确利益诉求、政策意图和维权决心。如此，才能真正地将综合国力的优势转化为化解争端的筹码。

注：表2结果表示为3次测定的平均值±标准差。

原儿茶酸是18种大豆中主要存在的酚类物质，定边小黑豆的含量最高1 191.00 μg/g。吉育82的含量最低181.01 μg/g。绿原酸的含量也占了相对较高的比重，没食子酸和肉桂酸含量较低。表2中所测的9种酚类物质的总量远低于表1中的总酚含量，这是由于大豆中除了已测的酚类物质外还含有其他较高的酚类物质未被检出，还有待研究。18种大豆中定边小黑豆的所检酚类物质含量最高，吉育82品种的含量最低。黑豆品种的酚类物质含量远高于黄豆的酚类物质含量，这可能与深色的豆皮含有的色素中的类黄酮物质含量高有关。

2.3 抗氧化能力与多酚、黄酮及酚类化合物的关系分析

如表3所示，参试的18种大豆品种之间的抗氧化能力存在明显差异。DPPH的抗氧化活性为3.91～28.36 mgTE/g，子洲小黑豆的DPPH抗氧化活性最高。FRAP的抗氧化活性为5.50～55.02 mgTE/g，横山老黑豆的FRAP抗氧化活性最高，神木鸡腰白的DPPH和FRAP抗氧化活性均最低。这表明黑色种皮大豆的抗氧化活性远高于黄色种皮大豆的抗氧化活性。为进一步研究酚类物质和其抗氧化活性间的关系，进行了总酚、总黄酮及单体酚与其DPPH和FRAP间的相关性分析。分析结果发现，采用DPPH法测定的抗氧化活性与FRAP法显著呈正相关(R2=0.966；P<0.01, 且总酚、总黄酮与总抗氧化能力相关性也较高，且相关系数达极显著水平(表4)。原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸和肉桂酸与总抗氧化能力相关性也较高， DPPH和FRAP法结果的相关系数都达极显著水平。

表3 各种大豆品种的抗氧化能力 单位：mg TE/g

表4 各种大豆抗氧化能力与多酚、黄酮及各种酚类化合物之间的关系

注：**，P<0.01。

3 讨论

3.1 不同大豆总酚及其组成之间的差异

3.2.3 气滞便秘证 主症：大便秘结，欲便不得。兼症：①胸胁痞满；②腹胀疼痛；③嗳气频作。舌脉指纹：①舌质红；②苔薄白；③脉弦，指纹滞。

衬砌板分缝宽度要均匀，伸缩缝切割要顺直，缝宽度和深度均应满足要求；填料填充前要对伸缩缝进行清理，清除缝内的灰末及松动混凝土余渣等杂物；新配置的胶料不得与剩余胶料混合使用。

本研究分析不同大豆品种发现，其总酚和总黄酮含量在各品种之间存在较大的差异，在黑豆品种中，黑色种皮的大豆多酚和黄酮含量是黄色种皮的豆类含量的将近2倍，黄豆的含量与黑豆品种中的黄色种皮黑豆的含量相似，这种差异可能是与黑色种皮中含有较高的花色苷有关。徐金瑞[15]和张芳轩等[16]对不同黑大豆种子的总酚和花色苷及抗氧化活性进行研究表明，北方和东北种子大豆的多酚、花色苷含量最高，黑大豆种皮中的总酚和花色苷是其抗氧化作用的重要物质。

本研究利用HPLC方法对多酚的组成进行了研究，从大豆种检测出9种酚类化合物，其中原儿茶酸是黑色种皮大豆的主要酚类组成物质，占所检的9种酚类含量的50%以上，咖啡酸在黑色种皮大豆中含量也较高，原儿茶酸和绿原酸是黄豆中的主要酚类物质。WANG等[17]对红枣中的酚类化合物组成进行了分析，但对豆类中的酚类化合物的组成的分析还未见报道。

1.2.2 总酚含量的测定

[2] 韩立德,盖钧镒,张文明.大豆营养成分研究现状[J].种子,2003(5)：57-59.

1-没食子酸；2-原儿茶酸；3-绿原酸；4-对羟基苯甲酸；5-咖啡酸；6-对香豆酸；7-阿魏酸；8-槲皮素；9-肉桂酸图1 标准混合溶液色谱图Fig.1 Chromatograms of standard mixture

1-没食子酸；2-原儿茶酸；3-绿原酸；4-对羟基苯甲酸；5-咖啡酸；6-对香豆酸；7-阿魏酸；8-槲皮素；9-肉桂酸图2 样品色谱图Fig.2 Chromatograms of sample

4 结论

本研究分析不同地区大豆种子发现，其总多酚、总黄酮含量在各品种子之间的变幅较大，黑豆品种中黑色种皮的大豆其总多酚和总黄酮较高，黄色种皮的黑豆品种和黄豆品种的含量较低。采用HPLC分析出多酚的9种组成成分，其中原儿茶酸是含量最高的酚类化合物。抗氧化活性与总多酚和总黄酮之间存在显著的相关性，与单体酚中的原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸和肉桂酸存在显著的相关性，相关系数均达到了极显著水平(P<0.01)，表明大豆中的总酚和总黄酮是其抗氧化作用的重要物质基础。

参考文献

[1] 刘澜.大豆的营养成分及其综合利用前景[J].内蒙古民族大学学报,2014,29(2):175-177.

本研究利用DPPH自由基清楚能力、FRAP总抗氧化能力分析了不同豆类的抗氧化活性，2种方法采用了统一的抗氧化标准物质Trolox 为参照，使得不同实验室的研究结果之间具有较好的可比性，DPPH和FRAP具有较高的正相关性。本研究测得的黑色种皮的FRAP抗氧化能力最高达到55.02 mgTE/g，其中黑色种皮的大豆抗氧化活性远高于黄色大豆，是其抗氧化活性的10倍左右。总酚和总黄酮与DPPH和FRAP抗氧化活性有显著的正相关性，含量较高的原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸与抗氧化也有显著的正相关性。本研究结果可以为以培育高营养和(或高活性)的大豆种子为目的的育种研究工作提供指导。

大豆种子资源：18种大豆种子均从横山种子公司获得，其中6种黑豆品种，12种黄豆品种。

要切实提升对纪检监察工作的认识。从工作实践来看，认识上的误区主要有两种：一种认为纪委的监督阻碍了工作效率的提升，片面地把监督与发展对立起来，因而存在应付监督、不愿监督的现象，甚至表现为一定形式或程度的抵触情绪，不利于监督工作的正常化、规范化、常态化；另一种是把纪委的监督当“挡箭牌”，有的部门自己不履行检查与监督职能，而是把纪委推到一线，甚至事事都要有纪检部门人员参加，并为其决策“签字背书”，这种“越位”“错位”现象把纪检部门推向了“监督不是、不监督也不是”的两难境地。

随着护理事业的发展，男护已经成为护理队伍中不可缺少的重要组成部分。护理工作不同于一般服务行业的从业人员，工作要求专业性、技术性、知识性较强，因而男护在就业方面有着较高的优越性。所以男护生进军护理行业势在必得，通过此次调查，可以看出我院男护生对护理行业就业意向率较高，对护理行业认可度也较高。男护生希望大一就接受就业指导，所以作为教师在日常教学中就应该给学生多提供相关的就业指导知识，其次要帮助学生提高求职技能。

[3] GINJOM I R, D'ARCY B R, CAFFIN N A,et al. 2010. Phenolic contents and antioxidant activities of major australian red wines throughout the winemaking process[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010,58(18):10 133-10 142.

2）尽管英语专业大三学生的英语综合能力较之低年级学生有较大提高和进步，但是由于语言环境的限制，他们用英语练习翻译和交流的时间并不多，所以容易受汉语母语的影响，做汉译英的翻译练习时，不可避免地把汉语中的一些词语，短语以及句型与英语相互联系，导致他们的译文里频繁地出现“中国式”英语。学生们的译文翻译腔较重，译文往往只是勉强达意，干瘪生硬，缺乏可读性。

[5] OKARTER N, LIU Ruihai. Health benefits of whole grain phytochemicals [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2010, 50(3): 193-208.

[6] XU B J, CHANG S K C. Antioxidant capacity of seed coat, dehulled bean, and whole black soybeans in relation to their distributions of total phenolics, phenolic acids, anthocyanins, and isoflavones[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(18):365-8 373.

总之，基于云班课的混合式教学方式利用现代技术把手机化“敌”为“友”，混合多种教学形式发挥教师脚手架功能帮助学生知识的内化，促进学生的课堂参与度最终英语能力得到提高。

[7] TAKAHASHI R, OHMORI R, KIYOSE C,et al. Antioxidant activities of black and yellow soybeans against low density lipoprotein oxidation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005, 53(11):4 578-4 582.

[4] TABART J, KEVERS C, PINCEMAIL J,et al. 2009. Comparative antioxidant capacities of phenolic compounds measured by various tests[J]. Food Chemistry, 2009,113(4):1 226-1 233.

[8] 张清安,范学辉,张志琪,等. 沙苑子提取物中多酚含量的测定[J].食品科学,2010,31(14):178-181.

和田所处的南疆地区脱贫攻坚存在贫困面积广、脱贫难度大、生态环境脆弱、工业化城镇化水平低、社会发展滞后等诸多制约，是新疆扶贫攻坚的重点和难点，此次捐助将用于喀什塔什乡基础设施建设，助力当地扶贫攻坚。

[9] 田金河,曾庆孝,杨程芳. 不同显色方法测定绿豆壳中黄酮含量的比较研究[J].粮油加工与食品机械，2003(11):60-62.

[10] TI Huihui, LI Qing, ZHANG Ruifen, et al. Free and bound phenolic profiles and antioxidant activity of milled fractions of different indica rice varieties cultivated in southern China[J]. Food Chemistry, 2014,159,166-174.

[11] ATOUI A. Tea and herbal infusions: Their antioxidant activity and phenolic profile[J]. Food Chemistry, 2005, 89(1):27-36.

[12] TADOLINO B, JULIANO C, PIU L. Resveratrol inhibition of lipid peroxidation[J]. Free Radical Research, 2000, 33(1): 105-114.

[13] Benzie I F F, Strain J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”. The FRAP assay[J]. Anal. Biochem. 1996, 239(1):70-76.

[14] 李思荻,赵永焕.东北几种豆类提取物的体外抗氧化活性研究[J].粮油工程，2010(4):54-56.

[15] 徐金瑞，张名位，刘兴华,等. 黑大豆种子抗氧化能力及其与总酚和花色苷含量的关系[J].中国农业科学，2006,39(8):1 545-1 552.

[16] 张芳轩，张名位，张瑞芬,等. 不同黑大豆种子资源种皮花色苷组成及抗氧化活性分析[J]. 中国农业科学, 2010,43(24):5 088-5 099.

[17] WANG Bini, Liu Fenghai, CAO Wei, et al. Distribution of phenolic acids in different tissues of jujube and their antioxidant activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(4), 1 288-1 292.

Comparisons of phenolic composition and antioxidant activity in 18 different varieties of soybean

ZHU Yi-lin, ZHANG Hai-sheng*, YANG Shu-fang, ZHAO Xin-shuai, XUE Huan-huan

(Food Engineering and School of Nutrition Science of Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China)

The total phenol content, the composition of polyphenols and antioxidant capacity in 18 different varieties of soybean were studied to provide guidance for breeding of high nutrition and highly active soybean germplasm research. Soybeans from Yulin, Shanxi province were used as materials; DPPH radical-scavenging and FRAP assay were conducted. Total phenolic content was measured by Folin-Ciocalteau method. Phenolic constituents were identified by HPLC and the correlation between antioxidant capacity and phenolic content was measured with Pearson correlation coefficient. The results showed obvious differences in total phenol content, jingbian black soybean have the highest content, up to 5.07 mg/g; nine phenolic substance were identified by HPLC : gallic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid, p-hydroxybenzoic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, quercetin and cinnamic acid; among which protocatechuic acid, chlorogenic acid and caffeic acid were in high concentrations. There were big variations in contents of the above nine phenolic compounds and total phenolic content in the examined soybeans. Extremely significant (P<0.01) correlations were found between antioxidant capacity and total phenolic content, between antioxidant capacity and flavonoids content, between antioxidant capacity and protocatechuic acid, chlorogenic acid and caffeic acid content , respectively.

soybean; total phenolics content; phenolic compounds; antioxidation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701040

硕士研究生(张海生副教授为通讯作者,E-mail:hshzh1965@snnu.edu.cn)。

2016-04-25，改回日期：2016-06-17