嵌合抗原受体T细胞在白血病中的研究及应用

王文媛，李莉娟，许丽丽，周 文，张连生

(兰州大学第二临床医学院 兰州大学第二医院 血液科，甘肃 兰州 730030)

·综述·

嵌合抗原受体T细胞在白血病中的研究及应用

王文媛，李莉娟，许丽丽，周 文，张连生

(兰州大学第二临床医学院 兰州大学第二医院 血液科，甘肃 兰州 730030)

嵌合抗原受体T细胞是通过单抗识别肿瘤抗原，将抗原抗体的高亲和性与T细胞的杀伤作用相结合，通过非MHC限制性的方法特异性杀伤肿瘤细胞。目前嵌合抗原受体T细胞CD19在治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)及慢性淋巴细胞白血病(CLL)中均取得了良好的疗效。本文将嵌合抗原受体T细胞在ALL及CLL中治疗进展做一综述。

白血病，T细胞;T淋巴细胞；嵌合素蛋白质类

嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)T细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种新的细胞免疫治疗技术。目前，CAR技术已从基本理论研究过渡到临床应用，在血液系统肿瘤和实体瘤的治疗上取得了显著成绩。本文将CAR-T技术在急性淋巴细胞白血病(ALL)及慢性淋巴细胞白血病(CLL)的治疗进展做一介绍。

1 CAR-T作用机制

CAR-T疗法是通过单抗识别肿瘤抗原，将抗原抗体的高亲和性和T淋巴细胞的杀伤作用相结合，构建特异性CAR[1]。通过病毒载体、转位子融合、电穿孔等方式[2]将编码CAR的基因插入到T淋巴细胞使T淋巴细胞表达这种CAR，然后经体外扩增纯化这种基因修饰过的T细胞，输入到体内。CAR-T在体内特异性识别靶抗原，通过活化扩增及分泌细胞因子，以非主要组织相容性抗原(MHC)限制性的方式特异性杀伤靶细胞[3]。同时CAR-T细胞不仅可识别蛋白质抗原，也可识别糖类抗原[4]、蛋白多糖[5]、糖化蛋白[6]、神经节苷脂[7]，扩大了靶向抗原的范围。理想的肿瘤靶抗原是仅表达在肿瘤细胞上，而不表达在正常细胞上，也不进入循环系统，且为肿瘤细胞生长存活所必须，这样就大大减小了CAR治疗的选择压力[8]。

2 CAR的基本结构及发展

目前，大多数CAR由胞外抗原结合区[由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成， 中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体(singlechainfragmentvariable，scFv)]、跨膜区域和胞内信号转导区组成[9-10]。第一代CAR-T将免疫球蛋白样scFv和FcεRI受体(γ链)或CD3复合物(ζ链)胞内结构域融合形成嵌合受体[11]。第二代CAR-T细胞加入了共刺激分子，如CD28，CD27，CD134(OX40)[12-13]，CD137(4-1BB)[14]，DAP10[15]。这些共刺激分子能提供不同的效应功能，相比于第一代有更强的抗肿瘤活性[10，16-17]。第三代CAR-T包含了更多的共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒活性、增殖性与存活时间，促进细胞因子的释放[18](图1)。第四代CAR(又称TRUCKs)，是在第三代CAR的基础上增加了编码CAR和(或)其反应性启动子的载体，在转基因产生的细胞因子作用下CAR产生有效信号，并能够招募免疫系统其他成员，放大抗肿瘤免疫效应[15，19](图2)。

3 CAR-T在B系白血病治疗中的应用

目前，在CAR-T治疗中已经有很多靶抗原，虽然CD19不是最早提出的肿瘤靶抗原，但是目前研究最成熟的，很多临床试验都是基于CD19进行研究的。CD19可作为一种理想的靶抗原，因为它可表达在大多数的B细胞恶性肿瘤上，包括B-ALL，CLL等，且不表达在造血干细胞上，即使消除所有的CD19+B细胞，临床也是可治疗的[20]，但潜在的缺陷是CD19的表达不是肿瘤发生所必需的细胞表型，同时表型变异及逃逸也在相关研究中被提到[21-22]。

3.1CAR-T在急性淋巴细胞白血病中的应用 急性淋巴细胞白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。临床结果显示，CD19在治疗急性淋巴细胞白血病中取得了良好的疗效，甚至在复发难治和化疗无效的患者中。

图1 第一、二、三代CAR的结构

图2 第四代CAR/TRUCK的基本结构

2011年来自MSKCC的Brentjens等[23]首次报道应用CD19-CART治疗1例ALL得到完全缓解。然后再次应用CD19CAR-T细胞治疗16例复发成人B-ALL[24]，行淋巴细胞清除后输注CAR-T[25]，CR率达88%(75%MRD-)。所有的患者在输注后的1～2周CAR-T的数量达到高峰，且在输注后的2～3月仍可检测到CAR-T细胞[26]。2015年研究组再次纳入33例成人B-ALL，在可评估的32例患者中，CAR-T输注后CR率达91%，MRD阴性达82%，有趣的是，2例复发的患者CD19阴性。2013年来自宾夕法尼亚大学的Grupp等[27]首次报道应用CD19CAR-T细胞(CTL019细胞)治疗2例经异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT)治疗后复发难治的前B-ALL患儿，输注后CTL019细胞在患儿体内扩增超过1 000倍，并可在骨髓及脑脊液中检测到。输注后1个月外周血及骨髓CD19阳性细胞均被清除，且获得骨髓形态学CR，MRD低于0.01%，其中1例基因水平持续缓解达9月，另1例则在缓解2月后复发，但复发后的原始细胞不表达CD19，推测这可能是对CAR-T治疗耐药的原因。2014年Grupp等[21]将病例扩大至30例，其中儿童25例，包括18例allo-HSCT后复发的B-ALL患者，进一步证实了CAR-T细胞治疗的良好疗效，其CR率高达90%，在外周血、骨髓及脑脊液中均可发现CTL019细胞的扩增。从长期疗效看，6个月的无事件生存率(EFS)达67%，总生存率(OS)达78%。NCI研究组运用CD19CAR-T治疗20例复发难治的ALL，14例患者达CR(70%)，其中12例MRD阴性，2例在输注后3～5月复发，检测发现CD19阴性[28]。2015年欧洲血液学会议上报道，48例ALL患者经CAR-T治疗后，可达94%的CR率及72%的DFS(6个月)[29]。

总之，多个研究组提出运用CD19CAR-T治疗复发难治的B-ALL取得了良好的疗效，在成熟的研究组中取得了88%～94%的CR率，但后期的随访很难进行，因为大多数患者在缓解后接受了造血干细胞移植，无法准确评估其治疗效果。在未行造血干细胞移植的患者中，部分患者再次复发，首先可能与CD19阴性的白血病细胞有关，表明在治疗过程中出现了免疫逃逸；其次，可能与体内CAR-T细胞的缺失有关，表明修饰的T细胞只能暂时地控制肿瘤细胞，而不能达到完全清除。

3.2CAR-T慢性淋巴细胞白血病中的应用CLL是主要发生在中老年的一种B淋巴细胞克隆性增殖的肿瘤性疾病，虽然目前提出很多靶向治疗药物及免疫治疗的措施，但除了造血干细胞移植外，耐药的发生使得其仍是一不可治愈的疾病。目前已有大量的临床研究证实运用CD19-CART治疗复发难治的CLL取得了良好的临床疗效。

2011年Porter等[30]应用第二代CD19-CAR-T细胞治疗了3例CLL患者，其中2例CR，1例PR。研究结果显示，CAR-T细胞不仅能在体内扩增1 000倍以上，而且能在患者外周血和骨髓中保持治疗活性达6个月，且发现部分CD19-CAR-T细胞以记忆T淋巴细胞形式存在，存活时间达3年之久，当再次遇到CLL细胞时候能够快速活化并发挥杀伤作用。2014年Porter等[31]在一项Ⅱ期随机临床试验中提到CD19-CAR-T治疗CLL的OS率在35%～57%，所有反应的患者CAR-T在体内的存活时间达到4年。2015年运用CD19-CAR治疗14例复发难治的CLL，OS率达57%(8/14)，其中4例CR，4例PR，在反应的这些患者中，CAR-T细胞可存活4年之久，最让人欣喜的是，CR的4例患者MRD持续阴性达4年之久[32]，此研究结果也被后来的其他学者在类似临床试验中得到了验证。2016年Fraietta等[33]提出在CLL患者中依鲁替尼可增强CAR-T的功能及治疗活性，因此两者联合治疗CLL可能得到更好的临床疗效。

目前大多的临床试验表明，CAR-T在体内的增殖高峰时间约在输注后的2周，但在体内的存活时间差异较大，可能与CAR-T的结构有关。对输注后的CAR-T细胞的免疫表型进行分析，在输注后的早期可发现少量记忆细胞，在输注的后期主要以记忆细胞的形式存在[30]，这说明在这些患者中，CAR-T细胞可产生持久的记忆细胞来杀伤肿瘤细胞。有些患者甚至可达4年之久的微小残留病阴性，有治愈的可能。总之，不同的临床试验均提出CAR-T治疗CLL的有效性，但其都是小样本，反应率也相差较大，需进一步优化CAR-T的结构使临床疗效得到进一步的改善。

4 相关问题

虽然目前CAR-T是细胞免疫治疗研究的热点，其不仅依赖于CAR-T对于复发难治肿瘤的较高的CR率，还可能与长期的缓解有关，其具有持久的抗肿瘤活性，但最短的缓解时间还未知。目前初始的CR率在不同的研究组不同，因为不同研究组采用不同的T细胞影响CAR的设计，不同的共刺激分子、基因转染技术、临床设计以及不同的患者肿瘤负荷，导致临床结果的差异。同时，因为成人与儿童胸腺功能和T细胞亚群的差异及免疫衰老，这可能解释了为什么CAR-T在儿童中有更好的疗效。

通常CAR-T在CLL患者体内的存活时间长于ALL，但ALL的CR率高于CLL[34]，且相比于ALL的细胞因子释放综合征(cytokinereleasesyndrome，CRS)，CLL的严重程度明显低于ALL，这可能有以下几个原因，首先来源于CLL的CAR-T细胞因为本身T细胞的功能紊乱而导致功能异常[35-36]；其次，需要进一步明确CAR-T进入淋巴结与骨髓的能力是否相同；此外T细胞抑制受体的免疫抑制作用，免疫抑制相关细胞因子的产生，不同类型免疫细胞的产生都可能不同程度地影响CAR-T的疗效[37]，使得CLL细胞可能处于抑制CAR-T功能的肿瘤微环境中。还可能与CLL持续表达的抗原特点及其肿瘤生长动力学的差异有关[31]。

对于运用CAR-T治疗后的B-ALL再次复发的患者目前仍然是很棘手的问题。CAR-T细胞的活性及持久性的降低导致B-ALL中CD19的原始细胞仍存在，可通过进一步优化CAR-T的设计、基因转移技术，使产物最大化来发挥杀伤作用，从而进一步提高反应率。第二代及第三代即可通过更强地激发T细胞的持久性而避免了复发。但是对于CD19阴性的原始细胞，其无法通过CA19-CART治疗，单一的靶向抗原在肿瘤抗原变异或缺失的时候无法靶向治疗。Haso等[38]发现运用CD19-CART治疗的B-ALL中，有2例患者的原始细胞CD19阴性，而CD22持续阳性，遂可通过设计CD19-CD22-CART治疗这类患者。联合CD19和CD22设计的CART可能避免肿瘤抗原的变异或缺失所导致的治疗无效，但需要进一步的研究。再者，CAR-T治疗能否成为异基因造血干细胞移植的桥梁，是一个开放性话题。目前对于复发难治的B-ALL，异基因造血干细胞移植是目前标准治疗方案，但因复发难治患者的高肿瘤负荷使得其无法立即行造血干细胞移植，CAR-T可使这些患者达到2次甚至3次缓解，使得患者可再有机会进行移植，从而取得良好疗效。

总之，虽然CAR-T免疫治疗在B-ALL及CLL患者中取得了较好的疗效，但不同研究组之间临床疗效的差异、治疗后复发以及治疗过程中细胞因子风暴等不良反应的处理仍是CAR-T广泛应用于临床前亟需解决的问题。应进一步优化CAR的设计，革新基因转染技术，选择理想的效应细胞，同时还需合理的临床设计，寻求新的肿瘤靶抗原，克服免疫抑制的肿瘤微环境，增强肿瘤组织的趋化功能，增强效应细胞的扩增能力，以进一步提高CAR-T的免疫治疗疗效，从而为患者提供更大的收益。

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张连生，Email:zhangliansheng@medmail.com.cn

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1004-583X(2017)04-0347-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.04.019

2017-02-14 编辑:武峪峰