烟草卵细胞特异表达基因的克隆与分析

罗 岸

(长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434023)

烟草卵细胞特异表达基因的克隆与分析

罗 岸

(长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434023)

构建烟草卵细胞和合子的cDNA文库，通过抑制性差减杂交和镜像选择进行卵细胞特异表达基因的筛选。筛选结果得到一个卵细胞特异表达的，与胱天蛋白酶基因类似(CASP-like)的基因NtEE1。生物信息学分析表明，NtEE1蛋白由194个氨基酸组成，含有4个跨膜结构域。NtEE1-GFP融合蛋白的亚细胞定位也显示，该蛋白可能存在于质膜和核膜上。同时扩增拟南芥actin11基因的启动子序列驱动核定位GFP的表达，并对烟草进行异位转基因，结果发现，actin11在烟草卵细胞中具有较强的启动子活性。这些研究结果可以为通过RNAi和过表达来研究NtEE1基因在烟草卵细胞发育和在精、卵细胞相互作用中可能的功能提供理论基础。

卵细胞；跨膜结构域；烟草；配子相互作用

被子植物胚胎发育的起点源于合子。合子又称受精卵，由精、卵细胞相互融合而成。众所周知，在动物精、卵细胞的融合过程中存在着相互识别机制。而被子植物有着独特的双受精作用，来自花粉的两个精细胞分别与胚囊中的卵细胞和中央细胞融合，形成胚和胚乳，整个受精过程都发生在母体组织中，不易对受精事件进行观察与分析，因此目前对被子植物精、卵细胞在融合过程中存在的相互作用机制还未明确。

对于这个问题的研究可以采用两种手段：一是利用拟南芥的受精障碍突变体进行分析，不过不同的突变体研究结果有着相互矛盾之处[1-5]；二是利用分离技术获得离体的植物精、卵细胞进行生理生化和分子生物学检测，寻找与配子识别、配子结合等相关的基因和蛋白质。自Cass[6]和胡适宜等[7]分别首创精细胞和卵细胞的分离技术以来，水稻、小麦、玉米、烟草、拟南芥、蓝猪耳等许多重要的农作物和模式植物的雌雄配子都已获得[8-16]。而基于cDNA文库构建技术、基因芯片技术和基因组深度测序技术的发展，目前已经在小麦[8-9]、烟草[10-11]、拟南芥[12]、水稻[13-16]的精、卵细胞中检测到多种多样的基因，这为筛选配子相互作用相关基因提供了广泛的资源和可行的技术路线。

为探索植物配子融合的互作机制，特别是对精、卵细胞在融合过程中相关基因和蛋白的筛选，本实验室利用分离的烟草卵细胞和合子分别构建其cDNA文库，通过抑制性差减杂交和镜像选择进行卵细胞特异表达基因的筛选，获得一个卵细胞特异表达、具有跨膜结构的基因NtEE1，以期为进一步利用基因敲除和过表达技术来研究其在精、卵融合和卵细胞发育中可能的作用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

在pCOMBIA1302载体的骨架上进行改造，从而获得GFP融合蛋白表达载体，在pART27载体的骨架上进行改造，从而获得GFP核定位表达载体。大肠埃希菌DH5α感受态购自全式金生物技术有限公司。

1.1.2 植物材料

本试验所用植物材料为红花烟草品种SR1(Nicotianatabacumvar. SR1)。供试材料种植于武汉大学生命科学学院所属温室，室温25 ℃，光照16 h·d-1。

1.1.3 主要试剂

常用分子克隆所需试剂(全式金生物技术有限公司和天根生化科技有限公司)，SMART cDNA library kit 试剂盒(TaKaRa公司)，PCR-Select cDNA Subtraction kit 试剂盒(TaKaRa公司)， SMARTer® Pico PCR cDNA Synthesis Kit 试剂盒(TaKaRa公司)，Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥actin11启动子的克隆和载体构建

取拟南芥幼叶，使用CTAB法提取DNA，扩增actin11启动子序列，扩增产物经电泳检测正确后送样测序。启动子的扩增引物为actin11-F1： NNNNGGTACCAGTCAGTCGTACAAAGAAACTC；actin11-F2： NNNN TCTAGATTTCTATATCCTGTCAAAATTG。使用双酶切将扩增片段接入含有NLS:3×GFP的pCOMBIA1302载体中。

1.2.2 烟草卵细胞和合子的分离

按照文献中提供的方法，从授粉40 h的胚珠中分离到烟草卵细胞[17]，从授粉96 h的胚珠中分离到烟草合子[18]。细胞分离后被转移到含有2×lysis/binding buffer的0.2 mL EP管中，旋即放入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 mRNA的提取和cDNA的合成

被用于进行抑制性差减杂交的卵细胞和合子的mRNA通过Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 试剂盒提取。A SMART cDNA synthesis kit试剂盒则用于mRNA的反转和cDNA的扩增，A SMART cDNA library kit试剂盒用于文库构建。

1.2.4 抑制性差减杂交和镜像选择

抑制性差减杂交通过PCR-Select cDNA Subtraction kit试剂盒进行，并用于镜像选择[19]。 镜像选择得到的cDNA被克隆到T载体中，转化至大肠埃希菌DH5a中以进行差减分析。

1.2.5NtEE1 CDS的克隆和载体构建

以1.2.3节的cDNA为模板，用文库中筛选到的NtEE1的EST序列做参考设计引物，扩增NtEE1基因CDS序列。扩增产物经电泳检测正确后送样测序。引物为CDS-F1: NNNNGAGCTCATGGAAACAGGGAGCAATATGAATG；CDS-F2: NNNNTCTAGAAAGACGCCTGTTCTTATGGAGGTTC。使用双酶切将扩增片段接入含有GFP和35S启动子的pART27载体中。

1.2.6 NtEE1-GFP融合蛋白亚细胞定位和actin11启动子活性的观察

应用基因枪法将构建好的NtEE1-GFP融合蛋白载体导入洋葱表皮细胞，培养24 h后使用普通荧光显微镜观察。使用叶盘法将pactin11::NLS::GFP载体转入烟草中，分离F1代阳性植株的卵细胞进行荧光观察。

1.2.7 生物信息学分析

Omega软件可用于分析NtEE1基因EST序列的开放阅读框。在线分析软件Protparam、ProtScale和SOPMA可用于分析和预测NtEE1蛋白的氨基酸组成、基本理化性质及其二级结构。PSORT 软件可用于预测NtEE1蛋白的亚细胞定位。

2 结果与分析

2.1 烟草精卵细胞与合子的分离

不同于动物，被子植物的生殖发育过程深藏在母体组织中，配子识别、配子融合和合子激活等重要的发育事件，需要通过显微操作将植物的雌雄配子和早期胚胎分离出来进行观察研究。本实验室可分离得到活力良好的精、卵细胞与合子(图1)，这为筛选配子特异表达基因打下良好基础。观察烟草卵细胞可以看到其具有较大的液泡，将细胞核挤至一端，因此赋予卵细胞明显的极性(图1-B)。而精卵融合形成合子后，大液泡旋即消失，此时细胞核迁移至细胞中间，合子呈圆形，体积相比卵细胞而言明显变小(图1-C)。在受精后72～96 h，合子逐渐伸长，形成长型合子，细胞核则迁移至合点端(图1-D)，随后合子将进行不等分裂形成二胞原胚，开始胚胎发育过程。

A，精细胞；B，卵细胞；C，合子；D，长型合子。标尺=10 μmA， the sperm cell; B， the egg cell; C， the zygote; D， the elongated zygote. Bar=10 μm图1 烟草精、卵细胞与合子Fig.1 Gametes and zygote of tobacco

2.2NtEE1基因在卵细胞与合子中的差异表达

利用已经分离的卵细胞和合子分别构建cDNA文库，然后利用抑制性差减杂交和镜像选择进行卵细胞和合子特异表达基因的筛选。结果表明，NtEE1基因只存在于卵细胞cDNA文库中。随后分离新的卵细胞和合子分别构建cDNA池，利用半定量PCR进行检验，证实了NtEE1基因的确只在卵细胞中特异表达(图2)。利用Omega软件对NtEE1基因的EST序列进行分析，发现NtEE1基因的EST序列中含有一个完整的开放阅读框，长度582 bp。经过NCBI数据比对发现该基因拥有膜相关的结构域，推测可能编码一种胱天蛋白酶类似(CASP-like)的蛋白质。

2.3 NtEE1蛋白理化性质分析

使用ExPASy网站的Protparam工具分析NtEE1蛋白的一级结构，发现NtEE1蛋白一级结构由194个氨基酸残基组成，整个多肽链的分子量大小约为20.687 8 ku。软件预测该蛋白的理论等电点为10.14，因此NtEE1属于碱性蛋白。分析还发现20种基本氨基酸都存在于该种蛋白中，其中非极性的丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸含量较高，分别为12.4%、16.0%和12.9%。而极性带正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)有19个，极性带负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)有7个，脂肪系数为134.18。综合分析氨基酸序列组成，显示NtEE1蛋白较不稳定，不稳定系数达到33.64，且蛋白应具有较强疏水性而不是亲水性，平均总疏水性为0.857。

A，卵细胞cDNA池；B，合子cDNA池；C，NtEE1基因在卵细胞和合子中的差别表达A， the cDNA pool of egg cells; B， the cDNA pool of zygotes; C， the different expression of NtEE1 in the egg cell and zygote图2 卵细胞与合子cDNA池及NtEE1基因的表达模式Fig.2 The cDNA pools of the egg cell and zygote and the expression pattern of NtEE1

2.4 NtEE1蛋白二级结构、跨膜结构预测与亚细胞定位分析

生物体内有些蛋白质存在于细胞质膜上，其中一类膜蛋白的多肽链可以贯穿质膜的脂双层结构一次或多次，被称为跨膜蛋白。其跨膜结构域多数情况下为α-螺旋。使用ExPASy网站的SOPMA工具对NtEE1蛋白的二级结构进行分析，发现NtEE1蛋白的二级结构有4种形式，其中α-螺旋这类二级结构在NtEE1蛋白中含量最高，达到45.36%，所有α-螺旋在整个肽链中均匀分布(表1)。而利用ExPAYs网站的TMHMM工具对NtEE1蛋白进行跨膜结构域分析发现，该蛋白具有4个跨膜结构域，由此推断其很可能是一个跨膜蛋白(图3)。此外利用ExPASy 网站的PSORT工具和BaCelLo网站对NtEE1蛋白的亚细胞定位进行预测也证实其极可能位于质膜上。

克隆NtEE1基因构建NtEE1-GFP融合蛋白载体，使用35S启动子驱动其在洋葱表皮细胞的瞬时表达来验证NtEE1蛋白的亚细胞定位是否符合预测。由图4可以看出，作为对照的GFP蛋白在洋葱表皮细胞的细胞质、细胞质索和细胞核中强烈而均匀地分布，因为有中央大液泡的原因荧光主要集中在细胞周边。而NtEE1-GFP融合蛋白与GFP蛋白相比，其在细胞核内没有呈现出强烈均匀的荧光分布，而是在细胞周边和核膜表面有分布，推测其受跨膜结构域的影响而定位在膜上。

表1 NtEE1蛋白二级结构的预测

2.5 拟南芥actin11基因启动子在烟草卵细胞中的活性

获得 pactin11:: NLS::GFP 载体的阳性转基因植株后分离其F1代阳性植株的卵细胞置于荧光显微镜下观察拍照，结果如图5所示，拟南芥actin11启动子驱动的核定位GFP在烟草卵细胞中有较强的表达，可观察到清晰可辨的绿色荧光。因此该启动子可用于驱动下游基因在烟草卵细胞中表达，以研究烟草卵细胞特异表达基因的功能。

图3 NtEE1蛋白跨膜结构的预测Fig.3 Prediction of the transmembrane domains of NtEE1

A、C，洋葱表皮细胞中NtEE1-GFP荧光分布与明视野；B、D，洋葱表皮细胞中GFP荧光分布及其明视野。标尺=50 μmA，C： The bright field and the fluorescence of NtEE1-GFP in onion epidermal cells; B， D： The bright field and the fluorescence of GFP in onion epidermal cells. Bar=50 μm图4 NtEE1-GFP融合蛋白的亚细胞定位Fig.4 Subcellular location of NtEE1-GFP

A、B，actin11基因启动子驱动的GFP核定位荧光及其明视野。标尺=10 μmA， B： The bright field and the nuclear located GFP fluorescence promoted by actin11 in the egg cell. Bar=10 μm图5 烟草卵细胞中拟南芥actin11基因启动子的活性Fig.5 Promotor activity of actin11 in the egg cell of tobacco

3 结论与讨论

在烟草卵细胞中特异表达的NtEE1基因含有582 bp的CDS区， NCBI数据库显示绒毛状烟草、美花烟草、土豆和番茄基因组中均发现有类似序列的基因存在。NtEE1作为一种预测的与胱天蛋白酶类似(CASP-like)的蛋白质，可能在卵细胞的发育过程中起着某种独特的作用。对新获得的NtEE1蛋白序列进行分析，结果表明，其具有4个跨膜区域，洋葱表皮细胞中观察NtEE1-GFP融合蛋白的亚细胞定位，也发现其极有可能定位于细胞的核膜和质膜上。

植物的双受精过程涉及诸多的信号调控，它们广泛参与细胞识别、配子激活、质膜粘附与融合以及核融合等过程[20]。到目前为止，人们已经在精细胞膜表面发现了几个特异的膜蛋白参与配子间相互作用。除了早先在拟南芥中发现的内在蛋白GCS1以外，GEX2 是另一个在精细胞膜表面特异表达的蛋白质，其含有胞外免疫球蛋白样结构域，GEX2进化相对迅速，对于配子结合相当重要，这与哺乳动物和藻类的配子相互作用因子比较类似[21]。但是在卵细胞中至今只发现一种信号肽EC1，而非膜表面蛋白在配子相互作用中扮演重要角色。拟南芥的5个EC1基因(EC1.1-EC1.5)都编码信号肽参与激活精细胞，它们在功能上相互冗余。精细胞的内膜系统在接收到卵细胞通过胞吐作用分泌的EC1信号肽的信号后，会将HAP2/GCS1这种潜在的配子促融剂分配到精细胞表面以促进配子融合[22]。因此，植物精子上的膜表面蛋白可能与后生动物和藻类中的一样参与了配子间的结合和识别[21]。

NtEE1作为一个在卵细胞中发现的特异表达基因，表明在烟草卵细胞中也可能有一种独特的膜表面蛋白在发挥重要作用。因尚未获得NtEE1基因自身的启动子序列，鉴于actin11作为看家基因在植物各个组织中具有广泛活性，本研究对拟南芥actin11的启动子序列进行了克隆，用于驱动核定位的GFP表达。结果在转基因烟草的卵细胞中能观察到较强的绿色荧光，这说明actin11启动子序列在烟草卵细胞中具有较强的启动子活性。这为今后利用actin11启动子驱动NtEE1相关的RNAi和过表达构建以对NtEE1基因在精、卵相互作用和其在卵细胞发育中可能的功能进行分析打下了基础，可深化对植物配子发生和配子识别的分子调控机制的认识。

[1] NOWACK M K， GRINI P E， JAKOBY M J， et al. A positive signal from the fertilization of the egg cell sets off endosperm proliferation in angiosperm embryogenesis[J].NatureGenetics， 2006， 38(1): 63-67.

[2] GROSS-HARDT R， KAGI C， BAUMANN N， et al. LACHESIS restricts gametic cell fate in the female gametophyte of Arabidopsis[J].PloSBiology， 2007， 5(3): e47.

[3] PAGNUSSAT G C， YU H J， SUNDARESAN V. Cell-fate switch of synergid to egg cell in Arabidopsis eostre mutant embryo sacs arises from misexpression of the BEL1-like homeodomain gene BLH1[J].PlantCell， 2007， 19(11): 3578-3592.

[4] CHEN Z， TAN J L， INGOUFF M， et al. Chromatin assembly factor 1 regulates the cell cycle but not cell fate during male gametogenesis inArabidopsisthaliana[J].Development， 2008， 135(1): 65-73.

[5] INGOUFF M， SAKATA T， LI J， et al. The two male gametes share equal ability to fertilize the egg cell inArabidopsisthaliana[J].CurrentBiology， 2009， 19(1): 19-20.

[6] CASS D D. An ultrastructural and Nomarski-interference study of the sperms of barley[J].CanadianJournalofBotany， 1973， 51(3): 601-605.

[7] 胡适宜， 李乐工， 朱激. 烟草生活胚囊及胚囊原生质体的分离[J].植物学报， 1985， 27(4): 337-344. HU S Y， LI L G， ZHU J. Isolation of viable embryo sacs and their protoplasts ofNicotianatabacum[J].ActaBotanicaSinica， 1985， 27(4): 337-344. (in Chinese with English abstract)

[8] SPRUNCK S， BAUMANN U， EDWARDS K， et al. The transcript composition of egg cells changes significantly following fertilization in wheat (TriticumaestivumL.)[J].PlantJournal， 2005， 41(5): 660-672.

[9] DOMOKI M， SZUCS A， JAGER K， et al. Identification of genes preferentially expressed in wheat egg cells and zygotes[J].PlantCellReports， 2013， 32(3): 339-348.

[10] ZHAO J， XIN H， QU L， et al. Dynamic changes of transcript profiles after fertilization are associated with de novo transcription and maternal elimination in tobacco zygote， and mark the onset of the maternal-to-zygotic transition[J].PlantJournal， 2011， 65(1): 131-145.

[11] XIN H P， PENG X B， NING J， et al. Expressed sequence-tag analysis of tobacco sperm cells reveals a unique transcriptional profile and selective persistence of paternal transcripts after fertilization[J].PlantReproduction， 2011， 24(1): 37-46.

[12] WUEST S E， VIJVERGERG K， SCHMIDT A， et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes[J].CurrentBiology， 2010， 20(6): 506-512.

[13] ANDERSON S N， JOHNSON C S， JONES D S， et al. Transcriptomes of isolatedOryzasativagametes characterized by deep sequencing: evidence for distinct sex-dependent chromatin and epigenetic states before fertilization[J].PlantJournal， 2013， 76(5): 729-741.

[14] ABIKO M， MAEDA H， TAMURA K， et al. Gene expression profiles in rice gametes and zygotes: identification of gamete-enriched genes and up-or down-regulated genes in zygotes after fertilization[J].JournalofExperimentalBotany， 2013， 64(7): 1927-1940.

[15] OHNISHI T， TAKANASHI H， MOGI M， et al. Distinct gene expression profiles in egg and synergid cells of rice as revealed by cell type-specific microarrays[J].PlantPhysiology， 2011， 155(2): 881-891.

[16] RUSSELL S D， GOU X， WONG C E， et al. Genomic profiling of rice sperm cell transcripts reveals conserved and distinct elements in the flowering plant male germ lineage[J].NewPhytologist， 2012， 195(3): 560-573.

[17] 孙蒙祥， 杨宏远， 周嫦. 分离烟草胚囊的新方法及诱导卵细胞与助细胞原生质体的原位融合[J].植物学报， 1993， 35(12): 893-900. SUN M X， YANG H Y， ZHOU C. A new method for embryo sac isolation and in situ fusion of egg and synergid protoplasts inNicotianatabacum[J].ActaBotanicaSinica， 1993， 35(12): 893-900. (in Chinese with English abstract)

[18] 傅春梅， 孙蒙祥， 周嫦， 等. 烟草受精后胚囊和合子的分离及合子的离体分裂[J].植物学报， 1996， 38(4):262-267. FU C M， SUN M X， ZHOU C， et al. Isolation of fertilized embryo sacs and zygotes and triggering of zygote division in vitro inNicotianatabacum[J].ActaBotanicaSinica， 1996， 38(4):262-267. (in Chinese with English abstract)

[19] REBRIKOV D V， BRITANOVA O V， GURSKAYA N G， et al. Mirror orientation selection (MOS): a method for eliminating false positive clones from libraries generated by suppression subtractive hybridization[J].NucleicAcidsResearch， 2000， 28(20):E90.

[20] QU L J， LI L， LAN Z， et al. Peptide signaling during the pollen tube journey and double fertilization[J].JournalofExperimentalBotany， 2015， 66(17):5139-5150.

[21] MORI T， IGAWA T， TAMIYA G， et al. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis[J].CurrentBiology， 2014， 24(2):170-175.

[22] SPRUNCK S， RADEMACHER S， VOGLER F， et al. Egg cell-secreted EC1 triggers sperm cell activation during double fertilization[J].Science， 2012， 338(6110): 1093-1097.

(责任编辑 张 韵)

Detection and analysis of an egg cell-expressed gene inNicotianatabacum

LUO An

(CollegeofLifeScience，YangtzeUniversity，Jingzhou434023，China)

cDNA pools of the egg cell and zygote of tobacco were constructed， and suppression subtractive hybridization and mirror orientation selection were used to select the genes specially expressed in the egg cell. So a gene namedNtEE1 was found， which was CASP-like gene.NtEE1 encoded 194 amino-acid residues， in which 4 transmembrane domains existed by bioinformatics prediction. The subcellular localization of NtEE1-GFP also indicated that NtEE1 might be located on the nuclear membrane and plasma membrane. The promoter ofactin11 of Arabidopsis was chosen to express nuclear-located GFP. The vector was transformed to tobacco， and the promoter activity ofactin11 was proved to be intensive in the tobacco egg cell. These would provide a foothold to investigate the function ofNtEE1 in the development of egg cell and the mechanism of gamete interaction in tobacco.

egg cell; transmembrane domain; tobacco; gamete interaction

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.02

2016-07-28

长江大学自然科学基金项目(2014NSFY023)

罗岸 (1984—)，男，湖北荆州人，博士，讲师，主要从事植物生殖发育研究。E-mail: anluo@whu.edu.cn

S572；Q942.1

A

1004-1524(2017)03-0360-06

浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 360-365

http://www.zjnyxb.cn

罗岸. 烟草卵细胞特异表达基因的克隆与分析[J].浙江农业学报，2017，29(3)： 360-365.