水体中蓝藻水华分解产甲烷动态过程研究

胡万婷,唐 千,孙 伟,朱立峰,邢 鹏

(1.南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210046；2.中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室,江苏 南京 210008；3.中国科学院大学,北京 100039；4.南京信息工程大学应用气象学院,江苏 南京 210044)

水体中蓝藻水华分解产甲烷动态过程研究

胡万婷1,2,唐 千2,3,孙 伟2,4,朱立峰1,邢 鹏2*

(1.南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210046；2.中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室,江苏 南京 210008；3.中国科学院大学,北京 100039；4.南京信息工程大学应用气象学院,江苏 南京 210044)

在巢湖开展蓝藻分解的原位围隔实验,实验期间测定围隔中层水体溶解性甲烷浓度和主要理化因子,通过定量PCR的方法测定产甲烷菌mcrA基因拷贝数以及细菌和古菌16S rRNA基因拷贝数随时间的变化情况.结果显示:随着蓝藻有机质分解,水体产甲烷菌数量逐渐增加,溶解性甲烷浓度最高达到2.94mg/L;产甲烷菌m crA基因拷贝数与甲烷浓度具有显著的正相关关系;同时还发现水体中的亚铁离子(Fe2+)含量与产甲烷菌的数量具有显著的正相关关系.上述结果支持蓝藻水华爆发导致水体也成为甲烷生物合成热点区域的观点.本研究获得的结果有助于进一步分析不同产甲烷热点区域(水体和沉积物)对湖泊甲烷总体释放量的贡献情况.

甲烷；产甲烷菌；蓝藻水华；厌氧分解；巢湖

甲烷是大气中辐射强度仅次于二氧化碳的温室气体,其单分子增温效应是二氧化碳的25倍[1].大气中甲烷浓度的持续增长是由其源汇平衡的改变引起的.土壤、湿地和湖泊等生境中微生物分解有机质的产甲烷过程对全球甲烷产量有着巨大的贡献.据估计淡水湖泊对于自然界甲烷释放量贡献率为6%～16%[2-4],尤其是藻源性有机质丰富的富营养化湖泊,更有利于甲烷的生成[5],这些湖泊对局域乃至全球温室效应的贡献亟待定量分析和评估.

巢湖是我国污染最重的三大淡水湖泊之一[6],水体富营养化导致蓝藻水华持续爆发,8月水华爆发频度达到最大[7].微囊藻(Microcystis spp.)是巢湖夏季蓝藻的优势种[8],其柔软的细胞壁由复杂的糖类和蛋白质构成[9],容易被破坏和消化.大量微囊藻生物质的积累和分解会消耗水体中的溶解氧[10],造成局部湖区出现缺氧,甚至厌氧条件.溶氧条件是决定有机物分解途径和生成产物的关键因素[11].局部区域的缺氧会提高厌氧微生物尤其是产甲烷菌的活性.目前在巢湖还尚未开展过有关微生物驱动的产甲烷过程和机制的相关研究.

传统观念认为,富营养化湖泊沉积物才是甲烷产生的热点区域[12-13],然而水体中是否有甲烷产生、其产生机制以及参与的微生物类群尚不清楚.此外,湖泊主要理化环境因子对水体产甲烷过程存在何种影响尚不明确.本研究采用气相色谱结合荧光定量PCR(qPCR)技术,通过比较不同蓝藻添加水平下,无底和有底围隔下层水柱的溶解性甲烷浓度,分析水体细菌、古菌以及产甲烷菌甲基辅酶M还原酶A(mcrA)基因拷贝数的动态变化,试图揭示水体中甲烷浓度动态变化的影响机制,为深入认识富营养化浅水湖泊碳循环和湖泊甲烷释放提供野外数据支持.

1 方法

1.1 原位围隔设置和样品采集

2015年7月底在巢湖(北纬N31°31′49.01″东经E117°32′56.12″)岸带设置6个围隔,围隔尺寸为5.0m(长)×5.0m(宽)×3.5m(深).将围隔平分成有底围隔(底部密闭)和无底围隔(底部与沉积物和周围水体联通)2组,目的是探索在没有沉积物参与的情况下水柱中是否存在甲烷产生所需的环境条件.蓝藻直接从巢湖水面打捞富集.每组3个围隔分别设不添加蓝藻(Low),添加50L新鲜蓝藻(Middle)以及添加150L新鲜蓝藻(High).初始蓝藻生物量以叶绿素a (Chla)浓度表示,测定结果分别为15822.57,18131.60,22336.79μg/L.实验开始于2015年8月6日(第0d),而后于第2,5, 7,9,11,12d采集围隔中心水深2.0m处水样.

1.1.1 溶解性甲烷样品的采集 用5L量程的Niskin 采水器采集围隔下层湖水,通过乳胶管将水样从釆水器缓慢注入100mL的玻璃顶空瓶底,避免气泡和涡旋产生,并使水样溢出约瓶容积的一半时,慢慢抽出乳胶管.立刻用带聚四氟乙烯内衬的丁基橡胶塞和铝盖将瓶口迅速密封,并用锡箔纸包住样品瓶身,放到黑暗的保温箱里,低温避光保存,尽快运到实验室,4℃冷藏室保存,用作溶解性甲烷的测定.

1.1.2 水体理化因子分析样品采集 现场采用水质分析仪(YSI6920,美国)测定下层水柱的溶解氧(DO)、水温和pH.采水器里剩余的水样用洁净的棕色瓶子保存,用于下层水Chla、溶解性有机碳(DOC)和一些理化因子,包括总氮(TN)、总磷(TP)、硝酸根(NO3-N),亚硝酸根(NO2-N)、亚铁离子(Fe2+)的测定.将下层水样过滤到孔径为0.22μm的聚碳酸酯滤膜(GTTP04700, Millipore,美国)上,用于后续对产甲烷菌、古菌和细菌DNA的qPCR定量分析.

1.2 样品理化因子测定

TN、TP、NO3-N、NO2-N使用紫外分光光度计(UV-2450, Shimadzu公司,日本)测定. DOC分析运用总有机碳分析仪(TOC-V CPN, Shimad-Zu公司,日本).Chla采用丙酮提取法和紫外-可见光分光光度计(HP8452,Agilent Technologies公司,美国)测定.

1.3 甲烷测定

溶解性甲烷采用气相色谱(GC7900,天美公司,上海)的FID检测器测定,进样口温度160℃;柱温90℃;FID检测器220℃.首先取固定的水样50mL置于120mL的顶空瓶中,水浴50℃振荡平衡40min.用气密性针抽取顶空上方的气体500μL,注入色谱进样口,点击开始进行测样.根据甲烷分压-峰面积标准曲线(R2＞0.999)计算样品甲烷浓度,结果转化为单位体积水样含有甲烷的质量.计算公式[14]如下:

式中:TC为溶解性甲烷浓度,mg/L;p为甲烷分压, mol/mol;H为甲烷亨利定律常数;M为甲烷相对分子质量,g/mol;T为样品温度,°K;V1为顶空气体体积,mL;V2为水样体积,L.

1.4 水样基因组DNA提取

将过滤水样的滤膜剪碎,浸没于TES lysis buffer(20mmol/L EDTA, 100mmol/L Tris, 0.8%SDS, pH 8.12),采用酚/氯仿/异戊醇方法提取DNA,将DNA溶解在30μL无菌水中备用.具体的DNA提取步骤参见文献[15].

1.5 qPCR测定

1.5.1 标准品的制备方法 将提取的DNA分别进行细菌16SrRNA基因、古菌16SrRNA基因和mcrA基因的PCR扩增,引物序列和退火温度见表1.PCR反应体系为50μL,其中TAKARA Premix 25μL,前向和反向引物各2μL,模板DNA 1μL,无菌双蒸水20μL.PCR反应程序:95℃预变性5min,95℃变性45s,退火30s,72℃延伸1min,共进行30个循环,72℃延伸10min,4℃保存.PCR产物分别用1.2%琼脂糖凝胶电泳,运用胶回收试剂盒(DNA Fragment Purification Kit, TaKaRa公司,日本)将目的基因片段割胶回收纯化.标准品运用DNA浓度计(NanoDrop 2000c, Thermo Scientific公司,美国)进行DNA浓度测定.结果A260nm/A280nm为1.8～2.0,表明标准品DNA纯度可以用于qPCR.根据3种标准品DNA浓度分别计算它们的基因拷贝数.换算公式如下:

式中:C为标准品浓度,ng/μL.将母液分别做梯度稀释,制成108～104copies/μL一系列梯度浓度标准品分装冻存备用.

表1 细菌16SrRNA,古菌16SrRNA和产甲烷菌mcrA基因qPCR引物Table 1 qPCR primers for bacterial 16SrRNA, archaeal16SrRNA and mcrA gene of methanogen

1.5.2 样品qPCR检测 将3种标准品分别运用到qPCR的样品检测中.以提取的微生物DNA作为模板.qPCR反应体系20μL:SYBR® Premix Ex Taq™(Takara,日本)10μL,引物各0.5μL,模板DNA 1μL,无菌双蒸水8μL.qPCR反应在荧光定量仪(CFX96Touch, BIO-RAD, 美国)上完成.所有反应都设置两个平行,以及阴性对照(以无菌水为模板).3种目标基因定量都采用3步法.细菌16SrRNA基因定量:95℃预变性2min,95℃变性15s,56℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环(荧光信号在该处采集);熔解曲线分析,温度以1℃/30s的速度从60℃上升到95℃.古菌16SrRNA基因和mcrA基因都遵循:95℃预变性2min,95℃变性15s,53℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;熔解曲线分析,温度以1℃/30s的速度从60℃上升到95℃.3种标准曲线回归方程相关系数R2＞0.999,扩增效率在92%～105%之间,说明qPCR达到了良好的扩增效果.根据样品的Ct值计算样品的基因拷贝数,并将单位转化成copies/mL.

1.6 统计分析

运用SPSS20.0软件进行统计分析.分析围隔的有无底以及蓝藻添加量的多少对各种环境因子和甲烷产量以及3种基因拷贝数的显著性影响.对按无底围隔和有底围隔归类、并且符合方差齐性的所有变量进行配对T检验,对不合方差齐性的变量进行2个相关样本非参数检验;运用Pearson相关方法分析溶解性甲烷浓度与环境因子,如营养盐、金属离子、底物(Chla,有机碳)以及微生物数量(产甲烷菌,细菌,古菌基因拷贝数)的相关性.运用线性回归模拟甲烷产量和产甲烷菌数量的函数关系.

2 结果

2.1 不同蓝藻添加量对产甲烷浓度的影响

图1 不同蓝藻添加量围隔中层水柱溶解性甲烷浓度动态变化趋势Fig.1 Dissolved methane dynamics inmesocosms with different amount of Microcystis spp. biomass addition

实验期间围隔中水温为19.9～21.5℃,pH值为6.69～7.51.湖泊环境中溶氧条件是决定有机物分解途径和生成产物的关键因素.实验开始后6个围隔DO浓度始终均为0mg/L,指示围隔体系中一直维持缺氧的状态.6个围隔中水体Chla浓度均先增加,而从第7d都大幅度减少,至第12d各围隔Chla平均浓度为479.15μg/L(最小浓度低于166.96μg/L),仅为初始浓度的0.75%.Chla浓度的变化一定程度上反映了围隔中藻类的消亡过程,甲烷生成的底物可能大部分来自于蓝藻分解产生的有机质.

如图1所示,大部分围隔下层水柱中的甲烷浓度在初期都很低,随着时间推移增加,最高可达2.94mg/L.围隔的有无底对甲烷的产量具有显著影响(P＜0.05,图2).有底围隔的水柱中甲烷浓度高于无底围隔,尤其是当添加High水平的蓝藻时,有底围隔中的甲烷浓度一直处于最高.蓝藻添加量对下层水柱甲烷产量的影响因围隔有无底而存在差异.添加不同蓝藻量的无底围隔之间,甲烷产量差异并不显著;而在有底围隔中,蓝藻不同添加量组间差异显著(P＜0.05).在有底围隔中,蓝藻添加量越多,甲烷浓度越高,表明水柱中蓝藻赋存量会影响甲烷产量.

图2 不同蓝藻添加量在无底和有底围隔中溶解性甲烷浓度比较Fig.2 Comparison of dissolved methane concentration between mesocosms with and without bottoms

2.2 蓝藻水华分解过程中细菌、古菌和产甲烷菌数量变化

细菌和古菌16SrRNA基因拷贝数总体上具有一致的变化趋势(图3).在厌氧分解初期,6个围隔的水柱中细菌和古菌16SrRNA基因拷贝数均随时间推移而增多,几乎都在第5d达到峰值.细菌16SrRNA基因拷贝数最高6.85×109copies /mL,古菌的16SrRNA基因拷贝数最高也有8.22× 108copies/mL.各个围隔的产甲烷菌mcrA基因拷贝数呈现逐步增多的趋势,几乎均在第11d达到峰值.其中添加High水平的有底围隔下层水mcrA拷贝数最高可达2.15×108copies/mL,增加幅度约为初始浓度的93倍.

图3 不同蓝藻添加量围隔细菌和古菌16SrRNA基因以及产甲烷菌mcrA基因拷贝数动态变化趋势Fig.3 Dynamic of bacterial and archaeal 16SrRNA gene and methanogen mcrA gene copy numbers in mesocosms with and without bottomsunder different amount of Microcystis spp.

蓝藻添加量和围隔有无衬底对于细菌、古菌和产甲烷菌数量具有不同的影响.如图4a所示,在无底围隔中,细菌数量随着蓝藻添加量增多而增多,在无底围隔中结果相反.统计分析显示围隔有无底对细菌16SrRNA基因拷贝数存在显著影响(P＜0.05).图4b显示,蓝藻添加量在无底围隔中对于古菌数量的作用不明显.但是在有底围隔中,蓝藻添加量越多,古菌数量越多.有底围隔中古菌16SrRNA基因拷贝数显著高于无底围隔.图4c表明,在有底围隔中,产甲烷菌数量随着蓝藻添加量的增加而明显增多.蓝藻生物量对产甲烷菌具有重要影响(P＜0.05).当蓝藻添加量相同时,尤其是添加蓝藻量都为High水平,有底围隔中的产甲烷菌数量显著高于无底围隔.

图4 不同蓝藻添加量无底和有底围隔细菌和古菌16SrRNA基因以及产甲烷菌mcrA基因拷贝数比较Fig.4 Comparisonof bacterial and archaeal 16SrRNA gene and methanogenmcrA gene copy numbers betweenmesocosms with and without bottomsunder different amount of Microcystis spp.

图5 水体溶解性甲烷浓度与产甲烷菌mcrA基因拷贝数的相关关系Fig.5 The correlation between methane concentration and mcrA gene copy number

产甲烷菌的数量与甲烷产量变化趋势具有一致性,统计分析显示产甲烷菌mcrA基因拷贝数与甲烷产量显著正相关(Pearson r=0.855, P＜0.0001,图5).在分解后期,添加High水平蓝藻的有底围隔中,产甲烷菌mcrA基因高拷贝数可能是高浓度甲烷产生的原因.

2.3 与产甲烷过程相关的环境因子分析

甲烷生成过程可能受到水体理化因子和微生物自身对于底物利用能力的限制.环境因子间的相关分析结果显示,围隔中TN、TP浓度彼此密切相关;NO3-N浓度与Chl a浓度呈负相关(r= -0.377,P＜0.01),即蓝藻厌氧分解过程中随着Chl a浓度逐渐下降,NO3-N浓度升高.相关性分析还显示许多环境因子对产甲烷菌、细菌和古菌数量都存在潜在的影响.产甲烷菌数量与Chl a浓度和溶解性有机碳DOC均显著正相关,蓝藻生物质(以Chl a表征)分解过程向周围水体释放DOC,可以为产甲烷菌生命活动提供所需底物.此外还发现不论产甲烷菌mcrA基因拷贝数还是甲烷浓度都与Fe2+浓度显著正相关.产甲烷菌、细菌和古菌的基因拷贝数变化都与TN存在显著的正相关关系.水体中溶解性甲烷浓度除了与产甲烷菌数量相关,还与细菌、古菌数量存在正相关性.藻源性有机质降解过程是各种功能微生物共同作用的结果,某些功能菌群将蓝藻有机质大分子分解成小分子量的中间产物才可被产甲烷菌利用生成甲烷.

3 讨论

3.1 蓝藻水华分解形成的环境条件有助于甲烷的生物合成

产甲烷过程涉及到一系列酶促反应,其代谢过程受到环境因子(如温度、pH值和金属离子等)的影响.大部分产甲烷菌最适生长温度通常在4～20℃[20],实验过程中围隔中下层水温平均为20.7±0.6℃,适宜产甲烷菌生长繁殖.产甲烷菌最适生长pH值为近中性环境[21],本实验测得水体pH平均值为7.45±0.06,符合产甲烷菌对pH值的需求.

研究结果还显示,有底围隔水体Fe2+浓度为0.36～2.9mg/L,显著高于无底围隔(0.19～1.5mg/L).由于微囊藻对铁(包括二价铁和三价铁[22])具有较强的吸收与储存能力[23],分解过程导致细胞内存贮的铁元素释放.而且,低氧化还原电位的缺氧水体也有利于Fe2+的稳定存在[24].

相关分析显示,围隔水体中Fe2+与甲烷浓度具有极强的正相关性(r=0.764,P＜0.001).Fe2+对甲烷生成可能存在积极影响[25],一方面Fe2+是厌氧微生物不可缺少的微量元素,而且更是产甲烷菌生存必需元素[26],可以作为产甲烷菌的能量载体[27],另一方面Fe2+是许多酶的组成成分,还可以降低氧化还原电势[28].我们推测Fe2+大量存在可能有助于产甲烷的生物合成.关于Fe2+促进产甲烷过程的生物学机制有待进一步研究.

3.2 湖泊厌氧水体中存在剧烈的产甲烷作用

有研究报道,产甲烷菌主要存在于湖泊沉积物和具有厌氧环境的颗粒物中[29].本研究设置有底和无底围隔的处理,试图明确在水柱中是否存在藻源性有机质分解产甲烷所需的环境条件,换言之,通过原位模拟实验分析在无沉积物参与的情况下是否能够完成蓝藻有机质生产甲烷的微生物转化过程.

关于我国富营养化浅水湖泊水体产甲烷菌数量的报到并不多见.本实验较为系统的研究了水体中甲烷产生的环境条件以及产甲烷过程的动态变化.有底围隔中未添加蓝藻时产甲烷菌mcrA基因拷贝数就有4.64×104copies/mL,高于淡水湖泊Kivu水柱中mcrA基因拷贝数(4.15×102～3.35×103copies/mL)[18].添加High水平蓝藻的有底围隔在厌氧分解后期,mcrA基因数最高增加到初始浓度的近100倍,高达2.15×108copies /mL.这一数值超过了黑龙江、安徽、山东地区沼气池的沼泥样品发酵后期沼液中产甲烷菌mcrA基因拷贝数的最高值7.91×105copies/mL (仅比发酵初期的沼液中的产甲烷菌数量增加了2.1倍)[30],更远远高于Kivu湖夏末底层水柱中的产甲烷菌mcrA基因拷贝数(2.21×103copies /mL)[18].可见,藻源性有机质厌氧分解会引起产甲烷菌的快速增殖.

表2 主要环境因子,细菌16SrRNA、古菌16SrRNA和产甲烷菌mcrA基因之间相关系数Table 2 The correlation coefficient among major environmental factors, bacterial 16SrRNA, archaeal 16SrRNA and mcrA of methanogen

围隔水体中溶解性甲烷产量随着藻源性有机质厌氧分解而增多,平均峰值(1.08±0.44)mg/L,远远高于长江下游底层水体中甲烷的平均浓度[(0.88±0.49)×10-3]mg/L以及鄱阳湖入长江口的甲烷浓度(3.9×10-3)mg/L[31].而其他淡水湖泊,如芬兰南部城市一个富营养化湖泊Vesijärvi湖的下层缺氧水柱中甲烷平均浓度也只0.23mg/L[32].富营养化Kasumigaura湖水体溶解性甲烷浓度在夏末时期最高,但不超过0.056mg/L[33].蓝藻水华形成后的太湖梅梁湾水柱中的甲烷含量仅有0.37～0.67mg/L[29],但水体产甲烷菌数量未见报道.不仅如此,蓝藻水华分解后期水体中溶解性甲烷浓度最高达到2.94mg/L.而且当添加的外源性蓝藻有机质的量越多时,产甲烷菌数量也越多,这表明蓝藻生物量赋存为产甲烷菌提供厌氧环境和丰富的基质.外源有机质的累积刺激甲烷的生成[34].本研究结果表明,蓝藻水华频繁爆发的局部湖区,缺氧水体同样可以成为产甲烷的热点区域,因此,水华严重的湖泊中甲烷的生成绝不仅仅局限于沉积物中的反应过程.

4 结论

4.1 水华爆发导致的蓝藻生物质堆积分解,造成水体缺氧或者完全厌氧,显著促进了产甲烷菌的增殖.蓝藻水华不仅为产甲烷菌提供了厌氧环境,还为其提供了丰富的基质.

4.2 多种环境因子对产甲烷菌的数量和溶解性甲烷浓度存在影响,水体中Fe2+的积累可能是促进甲烷生成的诱因之一.

4.3 研究证实在缺氧水体中也能发生剧烈的产甲烷过程.藻源性有机碳在湖泊多位点的厌氧分解, 将加速富营养化浅水湖泊的碳循环过程,增加温室气体甲烷释放的风险.

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致谢：感谢中国科学院南京地理与湖泊研究所段洪涛研究员,杜瑛珣副研究员和佴兆骏同学对样品采集和部分环境数据测定的协助.

Dissolved methane dynamics during the degradation of organic matter derived fromcyanobacterial bloom.

HU Wan-ting1,2, TANG Qian2,3, SUN Wei2,4, ZHU Li-feng1, X ING Peng2*
(1.College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2.State Key Laboratory of Lake and Environment, Nanjing Institute of Geography Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China；3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China；4.Applied Meteorological Institute, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China). China Environmental Science, 2017,37(2)：702～710

In shalloweutrophic lakes, methane production during the decomposition of organic matter derived fromcyanobacterial blooms and associated factors for the whole process in the water column remain poorly understood. In this work, in situ mesocosms experiment in Lake Chaohu were carried out to stimulate the Cyanobacteria anaerobic decomposition. During the process, dissolved methane concentration and the main environmental factors were measured at the water bottom. Quantitative real-time PCR method was applied to analyze the abundance of mcrA gene as well as the bacterial and archaeal 16S rRNA genes in each sample. Results showed that with the biomass decomposition, the amount of methanogens increased gradually in accordance with the accumulation of dissolved methane in the water column (maximumconcentration 2.94mg/L). A significantly positive correlation was detected between mcrA gene abundance and the dissolved methane concentration. Furthermore, there was also a significantly positive correlation between ferrous ions (Fe2+) concentration and the methanogen mcrA abundance. Our results support for the notion that water column can be a hot spot for the biosynthesis of methane due to the outbreak of cyanobacterial bloom. This study helps to compare the relative contribution of methane production between water column and surface sediments during the cyanobacterial blooms degradation.

methane；methanogens；cyanobacterial bloom；anaerobic decomposition；Lake Chaohu

X524

A

1000-6923(2017)02-0702-09

胡万婷(1991-)女,安徽安庆人,南京师范大学硕士研究生,主要从事环境微生物学研究.发表论文1篇.

2016-06-16

国家“863”项目(2014AA06A509);国家自然科学基金资助目(31370508);中国科学院青年创新促进会(2014273);湖泊与环境国家重点实验室开放研究基金(2012SKL005).

* 责任作者, 副研究员, pxing@nigalas.ac.cn