葶苈生脉方中挥发油的羟丙基-β-环糊精包合工艺

2017-04-08王红芳张静宜侯芳洁李春花

中国老年学杂志 2017年6期

关键词：包合物含油率试液

王红芳张静宜侯芳洁李春花

(河北中医学院药学院，河北石家庄 050200)

葶苈生脉方中挥发油的羟丙基-β-环糊精包合工艺

王红芳张静宜1侯芳洁李春花1

(河北中医学院药学院，河北石家庄 050200)

目的以羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)为包合材料，制备葶苈生脉方中白术、桂枝的挥发油成分包合物,以改善其难溶性、不稳定性和提高其生物利用度。方法通过L9(34)正交设计试验，分别采用搅拌法、研磨法制备HP-β-CD包合物，以包合物收得率、含油率、包合率为评价包合工艺的技术指标，并利用紫外分光光度法和薄层色谱法对包合物进行验证，优选最佳工艺。结果包合最佳工艺为：挥发油与HP-β-CD比例为1∶10，2倍水量，研磨2 h达到最佳效果。结论该工艺制备的挥发油包合物的包合率高，方法简便、可行，为葶苈生脉方开发成现代中药制剂奠定了重要基础。

正交试验；挥发油；羟丙基-β-环糊精；包合物；薄层色谱法；紫外分光光度法

葶苈生脉方由红参、葶苈子、桂枝、白术等13味药组成，是全国名老中医邢月朋治疗慢性充血性心力衰竭(CHF)的经验方。方中白术、桂枝主要有效成分是以萜类及其衍生物为主的挥发油，现代药理研究已证实：桂枝中的挥发性成分具有中枢和外周性血管扩张作用，并能增强血液循环〔1〕，改善心肌缺血和供氧等状况〔2〕；白术挥发类成分有调节胃肠道蠕动、运脾利湿〔3〕、抑制心肌收缩等作用〔4〕，均为治疗气虚血瘀、阳虚水停型CHF的药效成分。但由于此类成分具有挥发性且在氧、光、热的作用下极易分解、变质，因此，有不宜贮存且生物利用度低等缺点。目前，国内文献尚无使用新型辅料羟醛-β-环糊精(HP-β-CD)对白术、桂枝混合挥发油进行包合的报道。本研究将运用搅拌法和研磨法制备包合物，并采用正交试验以包合物收得率、含油率、包合率为评价指标，筛选出最佳工艺，旨在掩盖不良气味、增加药物溶解度及提高药物的稳定性〔5〕，为该方开发为现代剂型提供理论基础。

1 材料

TG328B型分析天平(上海精科天平仪器厂)；TGL-16台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；UV-2450 紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海圣科仪器设备有限公司)；85-2型恒温磁力加热搅拌器(常州智博瑞仪器制造有限公司)；KQ-100E型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

HP-β-CD(山东滨州化学试剂厂)；桂枝、白术购于石家庄乐仁堂，经河北中医学院侯芳洁讲师鉴定符合2010版药典一部相关规定；无水硫酸钠、无水乙醇、环己烷、乙酸乙酯、石油醚(60℃～90℃)等均为分析纯(深圳市中发源生物科技有限公司)；双蒸水(自制)。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取按处方比例分别取白术、桂枝适量，采用本课题组前期研究确定的最佳工艺，即10倍量的水，浸泡6 h，提取4 h，得黄色油状液体，收集芳香水进行二次蒸馏提取，合并两次所得挥发油，离心(温度15 ℃，转速3 000 r/min，时间6 min)，无水硫酸钠脱水，过滤即得纯挥发油，备用。

2.2 挥发油空白回收率的测定〔6〕按《中国药典》2010年版一部附录XD项下“挥发油测定法”依法进行测定〔7〕。将1 ml所提混合挥发油置于装有沸石的圆底烧瓶中，加蒸馏水150 ml，蒸馏4 h，并按照“2.1”方法收集挥发油，准确读取挥发油的量。平行3次试验，计算挥发油的空白回收率。空白回收率(%)=回收挥发油量(ml)/挥发油加入量(ml)。结果发现，挥发油的平均空白回收率为64.0%。

2.3 挥发油包合率、包合物产率及包合物含油率的测定〔8〕称取制备好的挥发油包合物于圆底烧瓶中，加150 ml蒸馏水，混合均匀，按《中国药典》2010年版一部附录XD挥发油测定甲法提取挥发油，至油量不再增加时停止加热，冷却至室温，按照“2.1”项下方法收集挥发油，准确读取挥发油量(ml)，计算挥发油包合率，根据真空干燥所得的包合物质量计算包合物收得率及包合物的含油率，计算公式：包合物含油率= 包合物中挥发油质量/包合物总重量×100%；包合物收得率= 包合物质量/(HP-β-CD加入质量+挥发油加入质量)×100%；挥发油包合率=包合物中挥发油量/(挥发油投入量×空白回收率)×100%。

2.4 挥发油包合工艺的优选

2.4.1 研磨法包合物的制备通过查阅文献〔9〕，影响HP-β-CD 包合挥发油工艺的主要因素有挥发油与HP-β-CD的投料比(A)、加水量(B) 及包合时间(C)。采用L9(34)正交表安排实验，制备包合物；按照“2.3”方法计算各项指标，其中包合率是评价包合效果的重要指标，包合率越高，挥发油的包合效果越好，越有利于制剂的稳定性，故权重系数定为0.6；收得率在实际生产中具有重要意义，在投入量一定的情况下，收得率越高，包合效果越好，权重系数设定为0.2；含油率在控制制剂质量方面有重要意义，权重系数定为0.2〔10〕。计算公式为：综合评分= (包合率/包合率max)×0.6 +(收得率/收得率max)×0.2+ (含油率/含油率max)×0.2(包合率max、收得率max和含油率max分别是试验中各指标的最大值)。因素水平表见表1，正交实验安排及结果见表2，方差分析表见表3。

根据正交试验的结果(表2)可知，影响HP-β-CD包合工艺的因素顺序是C>A>B，最佳包合工艺为A2B3C2，即挥发油与HP-β-CD 比值为1∶10，加2倍量水，包合2 h。由表3方差分析可知挥发油与环糊精之比及包合时间对包合工艺有显著影响(P<0.05)。

表1 研磨法HP-β-CD包合正交试验因素水平

表2 研磨法制备包合物正交试验结果

表3 方差分析表

F0.05(2，2)=19

2.4.2 搅拌法包合物的制备根据相关文献〔11〕和正交实验结果筛选出搅拌法的最佳包合工艺：取HP-β-CD 12 g，加蒸馏水15 ml，置温度为30℃的磁力搅拌器上，搅拌，缓慢滴入1 ml挥发油(此挥发油用无水乙醇溶解，挥发油∶无水乙醇=1∶1，V/V)，包合2 h，取出冷却至室温，于冰箱中冷藏(24 h)，抽滤，用环己烷洗涤3次，每次10 ml洗去未包合的挥发油，40℃条件下真空干燥4 h，取出，备用。

2.4.3 最佳工艺确定分别用筛选的最佳工艺平行做3次实验，根据“2.3”方法计算包合物含油率、收得率及挥发油包合率，实验结果，搅拌法3组验证实验结果各指标的平均值分别为3.31%、80.51%、54.17%，研磨法3组验证实验结果的平均值为7.11%、80.61%、98.44%。由此可确定选用研磨法制备包合物，且该方法制备包合物的综合指标平均值为0.95，比正交表中9组实验评分结果都高。因此，本研究筛选出的研磨法制备包合物最优工艺条件A2B3C2合理、稳定、可行。

2.5 HP-β-CD 包合物的验证

2.5.1 薄层色谱法(TLC) 称取 HP-β-CD约0.1 g，用1 ml无水乙醇超声15 min，离心后取上清液，即得供试液1；称取包合物0.1 g，同上处理，即得供试液2；精密移取白术、桂枝混合挥发油0.1 ml，用无水乙醇(1∶1，V/V)稀释溶解，作为供试液3；取适量包合物用水蒸气蒸馏法提取挥发油，精密移取0.1 ml，同上处理，即得包合后所提挥发油供试液4；将挥发油与HP-β-CD物理混合，用5 ml无水乙醇超声溶解，离心后取上清液，即得供试品溶液5。吸取上述供试品溶液各10 μl，点于硅胶G薄层板上，以石油醚(60℃～90℃)-乙酸乙酯(20∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%香草醛浓硫酸溶液，105℃烘干至斑点清晰，见图1。结果：HP-β-CD供试液1和包合物供试液2均未见与供试液3、4、5相同的斑点出现，说明包合物已形成，且其表面无残留的挥发油。包合物供试液2没有显示与挥发油溶液3相同的斑点，而二者物理混合物即供试液5则与供试液3有类似斑点，说明包合物中挥发油与HP-β-CD并非简单的物理混合作用；而经包合物从新蒸馏得出的挥发油即供试液4与供试液3在相应的位置上分别显有斑点，且Rf值和颜色基本一致，证明在外界条件剧烈时，挥发油可从环糊精空腔中游离出来，且主要成分并未改变，即包合作用是可逆的。

2.5.2 紫外分光光度法(UV) 样品1、2、3、4、5于200～400 nm范围内作紫外扫描，见图2。结果：1、2样品无挥发油的特征吸收峰，而供试液 3、4、5在相同位置上有混合挥发油类似的吸收峰。说明挥发油已被HP-β-CD包合在空腔结构中并已经构成一种新的物相，且HP-β-CD表面无残留挥发油。同样亦可佐证挥发油包合前后主要成分的理化性质并无改变。

1：HP-β-CD；2：包合物；3：混合挥发油；4：包合物中所提挥发油；5：挥发油与HP-β-CD物理混合物图1 包合物验证的TLC图

图2 包合物验证的UV图

3 讨论

实验中提取的白术、桂枝混合挥发油经包合后可有效防止其挥发，减少了与外界接触，增加其稳定性，避免了传统工艺直接加入的弊端。之所以采用HP-β-CD对所提混合挥发油进行包合，是由于HP-β-CD是β-CD的C2、C3、C8位的羟基被羟丙基取代生成的衍生物，其水溶性更大。当挥发油被HP-β-CD包合之后可以明显增加难溶性药物的溶解度，有利于制备液体药剂。

基于HP-β-CD具有较强的吸湿性，因此对原料及其包合物要密封保存、注意防潮。

由于挥发油的溶解性差，在HP-β-CD溶液中无法溶解，制备时可先将其溶于少量适宜有机溶剂中，如乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯。考虑到生产实际的安全性、制剂过程中无毒性，宜首选乙醇作为挥发油的溶媒。实验中将挥发油乙醇溶液缓慢地边加边研磨滴入HP-β-CD溶液，目的是使其均匀分散，便于二者的相互作用。

HP-β-CD包合物的制备方法主要有搅拌法、研磨法、超声法，本研究只筛选了搅拌法和研磨法的最佳工艺。一是出于节能、省时、利于大生产考虑；二是使用超声法在制备包合物的预实验过程中发现，挥发油在水中的溶解性低而分散漂浮于水面，超声作用力小，使挥发油与HP-β-CD分子接触的机会少，致挥发油分子难以进入HP-β-CD分子腔中。因此，超声法包合白术、桂枝挥发油的效果不理想，故不予采用。

实验中采用搅拌法和研磨法对白术、桂枝所提混合挥发油进行包合后发现，研磨法制备的包合物粉末均匀、细腻，包合物效果更理想。究其原因可能是研磨过程中研磨力使HP-β-CD与挥发油充分接触，将挥发油分子挤入HP-β-CD分子腔中，故其包封效果更好。

本研究进行的空白回收率试验，所测量值偏低，可能是由于在水蒸气蒸馏的过程中挥发油有一定程度的散失，且部分乳化及黏附在器壁上所致，有待于进一步完善提高。

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