α-硫辛酸对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的保护作用

杜 斌 杨志勇 蔡维维 冯 磊 邱丽颖

(江南大学无锡医学院，江苏 无锡 214122)

α-硫辛酸对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的保护作用

杜 斌 杨志勇1蔡维维 冯 磊 邱丽颖

(江南大学无锡医学院，江苏 无锡 214122)

目的 研究α-硫辛酸(LA)对四氯化碳(CCl4)诱导小鼠肝纤维化的保护作用及机制。方法 75只ICR雄性小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(水飞蓟素)和LA低、高剂量组。自造模之日起，除正常组外，其余各组以2.5 ml/kg腹腔注射20%CCl4，每周2次，连续6 w。自造模之日起，LA低、高剂量组分别给予(100，300 mg·kg-1·d-1)灌胃，正常组和模型组小鼠给予1.0 g·kg-1·d-1的生理盐水灌胃，阳性对照组给予水飞蓟素(200 mg·kg-1·d-1)灌胃，连续给药42 d。末次给药2 h后乙醚麻醉，从眼内眦静脉取血，摘取肝脏，比较各组小鼠肝功能指标和肝脏组织病理学特征的差异。结果 LA低、高剂量组谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性明显低于模型组(P<0.01)；肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性较模型组明显升高(P<0.01)；丙二醛(MDA)含量显著下降(P<0.01)；通过Masson、HE染色光镜下观察组织病理学变化，观察到LA低、高剂量组可使炎细胞浸润程度、肝细胞水肿程度及肝脏纤维化程度较模型组有所减轻。结论 LA可明显减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化及肝脏炎症反应，其机制可能与抗氧化损伤有关。

α-硫辛酸；肝纤维化；四氯化碳

α-硫辛酸(LA)是一种万能抗氧化剂。有研究表明抗氧化作用可在细胞膜、细胞浆、细胞质和脂蛋白中得到发挥，可清除体内螯合金属离子、自由基等〔1〕，可促进机体能量产生，调节免疫系统，促进细胞自我修复，缓解炎症〔2〕。本实验利用腹腔注射四氯化碳(CCl4)的方法进行造模，建立小鼠肝纤维化动物模型，并灌胃不同剂量的LA，通过观察小鼠体重、血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，肝组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平，并观察肝脏病理组织学变化，以检测LA的保肝作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料、药品与试剂 ICR小鼠，体质量18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002，合格证书号：2007000564424。标准饲料，自由饮水。适应饲料后开始实验。LA(Sigma公司，批号12705243)；水飞蓟素(Sigma公司，批号BCBF9631V)；AST(批号20131226)、ALT(批号20131225)、SOD(批号20131025)、MDA(批号20131024)、考马斯亮蓝蛋白试剂盒(批号20140326)，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。TG16A-WS台式离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；TS-8型漩涡混匀器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；DK-8B型电热恒温水浴槽(上海精宏实验设备有限公司)；ME204E电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；ELX800全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；5804R多功能台式离心机(德国艾本德公司)。

1.2 实验动物分组与模型制作方法 ICR小鼠75只，随机分为5组，每组15只：即正常组，模型组，LA低、高剂量组，阳性对照组(水飞蓟素组)。自造模之日起，除正常组外，其余各组以2.5 ml/kg腹腔注射20%CCl4〔3〕，每周2次，连续6 w。自造模之日起，除正常组、模型组外，LA低、高剂量组分别给予LA100，300 mg·kg-1·d-1灌胃，正常组和模型组小鼠给予1.0 g·kg-1·d-1的生理盐水灌胃，阳性对照组给予水飞蓟素200 mg·kg-1·d-1灌胃〔4〕，连续给药42 d。末次给药2 h后乙醚麻醉，从眼内眦静脉取血并离心出血清。在肝右叶位置切取小块肝组织，置入10%中性甲醛缓冲液固定。其余肝组织分装于离心管中-80℃冰箱保存。

1.3 小鼠体重 给药第1天称重并记录，给药第42天称重并记录。1.4 肝脏组织学观察 另取肝右叶相同部位放入10%甲醛溶液中固定，常规HE染色，Masson染色光镜下观察组织病理学变化。

1.5 血清中AST、ALT活性的测定 眼眶取血，37℃水浴1 h，3 000 r/min离心15 min，取血清用于测定AST、ALT活性，各指标测定按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 肝组织指标的测定 取肝右叶相同部位的一小块肝组织，用冰盐水漂洗，剔除脂肪及结缔组织，吸水纸吸干，称重，然后放入10 ml离心管中；加入适量的冷生理盐水，2 000 r/min匀浆10 s，间歇30 s，反复3次制成10%的组织匀浆；使用冷冻离心机，4℃，3500 r/min离心10 min，取上清液测定肝组织中SOD、MDA的活性。各指标测定方法严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据的组间比较进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 对小鼠体重的影响 给药后第1天体重与给药后第42天体重相比，正常组小鼠体重升高，模型组小鼠体重下降，水飞蓟素组、LA高剂量组小鼠体重升高(P<0.01，P<0.05)，LA低剂量组小鼠体重无明显变化(P<0.05),见表1。

2.2 组织病理学检查 (1)HE染色：正常组肝小叶形态结构完整，肝窦及汇管区无异常，肝索排列规则，肝细胞形态正常，无炎性细胞。模型组肝索排列异常，肝细胞呈气球样变性肿胀，胞质疏松，染色较淡。LA低剂量组、高剂量组、水飞蓟素组较模型组肝窦明显，肝细胞的胞质均匀，气球样变性逐渐显著减少。LA对CCl4所致急性肝损伤的病理改变有恢复作用，可减轻炎性细胞浸润、肝细胞浊肿，促进肝细胞再生，表明LA对CCl4所致肝纤维化小鼠具有一定的保护作用。见图1。(2)Masson染色：正常组小鼠肝组织正常，肝小叶组织结构完整，未见胶原纤维增生。模型组小鼠肝组织与正常组比较，胶原纤维明显增多，形成胶原沉积且向门管区延伸明显，互相连结，未见假小叶形成，但肝组织的正常结构破坏显著。LA低剂量组、高剂量组、水飞蓟素组与模型组比较，肝胶原纤维减少明显，表明LA对CCl4所致肝纤维化小鼠具有一定的保护作用。见图2。

组别给药后第1天给药后第42天正常组25.9±0.743.1±1.62)模型组25.7±0.822.4±2.12)LA低剂量组24.4±0.734.4±1.0LA高剂量组23.4±2.034.2±2.71)水飞蓟素组24.7±1.235.3±1.32)

与给药后第1天比较：1)P<0.05，2)P<0.01

图1 肝组织HE染色(×100)

图2 肝组织Masson染色(×100)

2.3 对血清AST、ALT活性的影响 与正常组相比，模型组小鼠血清AST、ALT的活性均升高(P<0.01)，说明肝功能有损伤。与模型组相比，LA低剂量组、高剂量组、水飞蓟素组小鼠血清AST、ALT的活性均降低(P<0.01)。见表2。

2.4 对肝组织SOD、MDA含量的影响 与正常组相比，模型组小鼠肝组织中SOD含量降低，MDA含量升高(P<0.01)，说明模型比较成功。与模型组相比，LA低剂量组、高剂量组、水飞蓟素组小鼠肝组织中SOD含量升高，MDA含量降低(P<0.01)。见表3。

组别ASTALT正常组41.3±1.750.3±2.2模型组88.6±2.81)108.2±2.51)LA低剂量组60.1±2.22)63.4±2.62)LA高剂量组47.8±2.02)54.4±4.22)水飞蓟素组44.4±2.42)50.6±3.42)

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，下表同

组别SODMDA正常组28.1±0.90.60±0.05模型组22.4±0.51)0.88±0.061)LA低剂量组24.8±0.82)0.70±0.052)LA高剂量组25.5±0.72)0.65±0.042)水飞蓟素组26.7±1.12)0.62±0.042)

3 讨 论

肝纤维化是肝脏对细胞膜破坏、脂质过氧化反应、坏死组织机化再生等反复损伤修复的结果，是介于临床上各种慢性肝炎与进展至肝硬化的病理过程。CCl4是已知的经典肝纤维化诱导剂，有关CCl4诱导小鼠肝纤维化模型的方法已很成熟，已广泛用于保肝药物的筛选、肝细胞损伤及机制及血清学标志物的研究等。人肝损伤与诱导的动物肝损伤模型较为相似。ALT、AST分别主要存在于肝细胞质及肝细胞线粒体内，是肝功能异常的敏感指标。当肝脏发生炎症时会引起 ALT、AST 的升高〔5〕。自由基参与肝纤维化等多种病理过程，了解自由基反应、脂质过氧化与疾病的关系，可作为疾病的诊断、预后和抗氧化治疗的一个有用指标〔6～8〕。

本研究表明LA对炎细胞的浸润、肝细胞的肿胀坏死都有明显改善作用。α-LA干预可以有效降低肝组织MDA 浓度，提高SOD活性，对肝组织的氧化损伤具有保护作用〔9〕。α-LA干预组可降低肝损伤标志性酶AST、ALT活性，表明α-LA可拮抗镉致肝脏的损伤作用〔10〕。LA通过阻断转化生长因子(TGF)-β信号通路抑制肝脏PAI-1表达和纤维化〔11〕。LA通过弱化血小板源生长因子(PDGF)和TGF-β激活性肝星状细胞中的活性氧(ROS)-触发性信号通路抑制肝纤维化〔12〕。本实验研究发现，LA在小鼠肝纤维化实验保护作用中存在量效关系，这种量效关系的存在，可能与肝纤维化损伤的程度有关。LA可能通过减轻肝脂质过氧化损坏，致使胶原合成减少，纤维化程度减轻，保护了CCl4诱导小鼠肝纤维化。

1 Holmquist L，Stuchbury G，Berbaum K，etal.Lipoic acid as a novel treatment for Alzheimer′s disease and related dementias〔J〕.Pharmacol Therap，2007；113(1)：154-64.

2 Ghibu S，Richard C，Delemasure S，etal.An endogenous dithiol with antioxidant properties：alpha-lipoic acid，potential uses in cardiovascular diseases〔J〕.Ann Cardiol Angeiol,2008；57(3)：161-5.

3 Rowe RG，Lin Y，Shimizu-Hirota R，etal.Hepatocyte-derived Snail1 propagates liver fibrosis progression〔J〕.Mole Cell Biol，2011；31(12)：2392-403.

4 Li CC，Hsiang CY，Wu SL，etal.Identification of novel mechanisms of silymarin on the carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice by nuclear factor-κB bioluminescent imaging-guided transcriptomic analysis〔J〕.Food Chem Toxicol，2012；50(5)：1568-75.

5 Yu J，Wang Y，Qian H，etal.Polyprenols from Taxuschinensis var.mairei prevent the development of CCl4-induced liver fibrosis in rats〔J〕.J Ethnopharmacol，2012；142(1)：151-60.

6 张超贤，郭李柯，郭晓凤.电针联合贞芪扶正颗粒对肝纤维化大鼠自由基反应、NF-κB活化、TGF-β1 和CTGF、mRNA 表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(9)：2512-6.

7 王志旺，王瑞琼，郭 玫，等.甘肃产藏药五脉绿绒蒿有效部位对肝纤维化大鼠抗氧化系统的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(20)：5043-6.

8 王国贤，康雅萍，魏慧芳，等.α-硫辛酸对糖尿病大鼠肝脏损伤保护作用〔J〕.中国公共卫生，2013；29(5)：704-7.

9 丁 倩，董 媛，张福东，等.α-硫辛酸对高糖诱导GK大鼠肝氧化损伤的影响〔J〕.环境与职业医学，2013；30(10)：774-6，779.

10 陆 江，朱道仙，刘 静，等.α-硫辛酸对镉致大鼠肝脏脂质过氧化损伤保护作用试验〔J〕.中国兽医杂志，2012；48(3)：34-6.

11 Foo NP，Lin SH，Lee YH，etal.α-lipoic acid inhibits liver fibrosis through the attenuation of ROS-triggered signaling in hepatic stellate cells activated by PDGF and TGF-β〔J〕.Toxicology，2011；282(1)：39-46.

12 Min AK，Kim MK，Seo HY，etal.Alpha-lipoic acid inhibits hepatic PAI-1 expression and fibrosis by inhibiting the TGF-β signaling pathway〔J〕.Biochem Biophys Res Commu，2010；393(3)：536-41.

〔2015-04-19修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

中央高校基本科研业务费专项资金资助(No.JUSRP51412B)

邱丽颖(1965-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事药理学研究。

杜 斌(1983-)，男，实验师，主要从事药理学研究。

R572.2

A

1005-9202(2017)06-1320-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.007

1 阜阳市人民医院特需病房