诱变育种方法在霉菌中的应用
2017-04-07熊进黄魁英曹丁甘祥武陈琼
熊进,黄魁英,曹丁,甘祥武,陈琼
(广州市微生物研究所,广东广州510663)
诱变育种方法在霉菌中的应用
熊进,黄魁英,曹丁,甘祥武,陈琼
(广州市微生物研究所,广东广州510663)
介绍诱变育种方法在霉菌中的研究进展以及物理诱变、化学诱变、物理化学复合诱变的应用效果。研究表明,物理诱变方法比化学诱变方法应用广泛;利用物理诱变,适当结合化学诱变也取得不错效果。
诱变方法;霉菌;物理诱变;化学诱变
诱变育种是微生物选育最常用且行之有效的方法,在实际生产中,各种方法被不断运用,已经有很多诱变得到的高产菌株投入工业化生产。然而,其方法多种多样,物理诱变方法和化学诱变方法相互之间组合的形式也比较多,其有一个共同的特点就是不定向的突变。在霉菌中,因其种类繁多、分布广泛,又有菌丝和孢子等独有特性,故诱变育种有其比较独特的育种特点。目前普遍采用人工诱变育种的方式,主要包括物理诱变、化学诱变、生物诱变三大类[1-2]。本文主要介绍目前已经运用在霉菌上物理和化学的诱变方法以及效果,为提供诱变选择提供新思路。
1 物理诱变
物理诱变方法在菌株的选育方面应用广泛,尤其独特的特点,随着物理技术的发展,逐步发展成为诱变技术对人体伤害小,处理时间短,环境污染小等特点。
1.1 紫外线诱变技术
紫外线是最简单容易的物理操作技术,其突变具有不定向性,并且操作简单,条件容易获取,被广泛的运用于各种微生物的诱变处理,在霉菌中也得到了广泛的运用。采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行诱变,最终筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株米曲霉Y29,菌株的蛋白酶活力明显高于米曲霉3.042菌株,其中性蛋白酶活力可达9 180.98(U/g)[3]。陈亚光等[4]采用沪酿3.042米曲霉的孢子为对象,对其孢子进行紫外诱变,筛得到一株蛋白酶活力高且遗传稳定的突变株LY06,37℃培养44 h产酶活力由313 U/g曲料提高到556 U/g曲料,为原菌株的1.78倍,传代培养15次,蛋白酶活力基本保持稳定,没有明显的下降。屈二军等[5]以黑霉菌株W1作为出发菌株进行紫外线诱变,从中筛选出的高产纤维素酶菌株NW1的酶活均有不同程度的提高,较出发菌株W1提高了1.58倍。郭鲁宏等[6]以黑曲霉No.13为出发菌株,经紫外线诱变处理获得一株制备原生质体的起始菌,该菌株单宁酶活性比No.13提高55%。周长海等[7]以自然发酵的粟米酱中分离的野生型米曲霉为出发菌株(S),经分离、纯化后,采用紫外线诱变育种的方法,得到菌株Y26比出发菌株S酶活提高了近5倍,突变株Y34孢子数比出发菌株S提高了近19倍。对于霉菌而言,紫外线处理原生质体液和孢子液的效果是不一样的,很多试验都用原生质体比直接的孢子液正突变效果要大。
1.260Co γ射线
γ射线穿透物质后强度减小,但能量几乎不降低,运用于生物诱变具有很好的效果,这也是现在生物诱变技术里得到非常广泛运用的技术之一。陈建爱等[8]利用60Co γ射线辐照木霉(Trichoderma spp)菌株的诱变效果,使木霉分生孢子萌发率显著降低,孢子萌发时间加长,有的萌发菌丝长成畸形,并且随着照射时间的延长,萌发率急剧下降。杨平平等[9]利用60Co γ射线对黑曲霉447-92菌种产植酸酶的诱变效应,筛选出产植酸酶较高的菌株,经传代培养,该突变株具有稳定的遗传性状。梁新乐等[10]对绿色产色霉菌A-05菌株进行射线处理,确定了最佳剂量350 Gy,筛选出高产并且能够稳定遗传的菌株,阿维霉素发酵单位达到68.5 mg/L。宋安东等[11]以斜卧青霉(Penicillium decumbeus)A10为出发菌株,经450Gy射线诱变,筛选出纤维素酶高产菌株A50,发酵至60 h时,纤维素酶活和滤纸酶活均达到最高,分别为27.28U/mL和1.981 U/mL,较出发菌株A10分别提高了33.2%和45.59%。胡燕红等[12]以米根霉As 3.819为出发菌株,采用60Co γ射线进行诱变处理,以正突变率为指标,诱变剂量为400 Gy,通过筛选得到耐38℃高温的5号突变株mut-5经连续传代7次,遗传性状稳定,突变株发酵液中的乳酸含量提高了24.15%,乙醇含量降低了9.27%。很多试验都表明60Co γ射线对微生物具有良好的高产菌株作用。
1.3 超高压
超高压对微生物有多方面的影响,它不仅可使微生物细胞组分、体积形态发生变化,还可使微生物的基因表达和核酸结构及其生物学功能发生改变。随着人们各种新技术的运用,超高压被逐渐地应用于生物学各种领域中,并在许多方面得到了深入研究,特别是在食品方面取得了初步的应用[13-14]。王岁楼等[15]通过超高压力诱变技术筛选出了2株具有较大应用潜力的高压突变株,酶活比出发菌株分别提高了2.83倍和2.57倍,并且发酵时间缩短了1 d,增加了生产收益,缩短了生产时间。有些微生物在极端耐高压的条件下生存,压力保持一种平衡状态,通过打破这种平衡,来达到诱变的目的,引起了人们对耐高压菌的探索。
1.4 激光诱变
人们在微生物遗传育种中发现激光诱变具有操作简单、安全、正突变机率高、对菌株损伤小、诱变菌株较出发菌株比提高倍数大等特点,其在霉菌中也进行了很好的运用,特别是在黑曲霉中运用提高倍数较大,但是激光与微生物作用机制还不能完全被弄明白[16-17]。李俊刚等[18]研究表明激光对黑曲霉原生质体的致死率比对孢子的致死率高。激光对原生质体诱变比孢子正突变率要高,其最高突变株酶活提高了91%。彭益强等[19]通过激光辐射黑曲霉孢子液和原生质体液,表明原生质体比孢子耐受激光诱变的能力强,并且诱变正突变菌株较多,最终筛选到一株酶活提高达3.75倍的变异菌株。原生质体液和孢子液是霉菌诱变中比较典型的特征,并且霉菌产生的菌丝对液体的混匀也有一定的阻碍作用。
1.5 离子注入
曹小红等[20]选用N+离子束注入米曲霉诱变,注入时选择能量为20 keV,筛选得突变菌株TK-7,蛋白酶酶活较出发菌株提高36%。庞锐等[21]采用低能N+注入技术对米根霉As 3.819进行诱变选育,获得L-乳酸产量最高达到103.81 g/L的菌株,较初筛前提高了30.71%。古绍彬等[22]采用低能离子注入诱变对米根霉PW352进行改良获得高产L(+)-乳酸菌株RE3303产酸能力达131 g/L~136 g/L,最高可达140 g/L,产酸比PW352提高75%。龚加顺[23]以单宁酸酶高产菌株用低能N+离子注入黑曲霉9701,使得正突变率达到27.61%,筛选得到高产菌株比出发菌株酶活力提高了2.68倍,且遗传稳定性好。通过相关文献[24],通过离子注入的方法,运用不同的菌株处理发现菌株目的产物最大能提高到原来的16倍,在霉菌里面也能够提高到原来的15倍[25]。研究表明[26],离子注入处理是一种有潜力的微生物诱变育种新方法,且产生的菌株比原来菌株有较大的提高,正突变率较大,产生的新菌株遗传性能稳定。
1.6 微波
邵淑娟等[27]采用微波辐照方法对产凝乳酶的黑曲霉JG进行诱变处理,选育出具有遗传稳定性的突变株WB6-3、WB2-5凝乳活力分别比出发菌株提高了35%和14%。李永泉等[28]采用微波辐照,对黑曲霉木聚糖酶生产菌进行诱变处理,结果选育到一株产量较高的生产菌,发酵单位从15 000 U/mL提到21 500 U/mL所选育的菌株经多次传代,遗传性状十分稳定。
还有其它物理诱变技术的运用,例如超声波诱变[29-30]、航天诱变[31-32]、常压室温等离子体、重离子辐照、热效应等诱变新技术。
2 化学诱变
在现在的应用中,化学诱变有多种形式,既有运用某一种化学诱变剂进行的单因素诱变,也有组合其它化学诱变剂或其他多种诱变方法的复合诱变,还有化学诱变剂联合抗生素作用抗性筛选等。而化学诱变剂很多是致癌剂或剧毒药品,使用时须十分小心。
亚硝基胍在霉菌中单一的化学诱变中运用的很少,更多的是化学诱变剂结合物理诱变,并且取得很明显的效果。张同亮等[33]利用亚硝基胍对野生黑曲霉DH-010进行诱变,使用自制的培养基筛选出10株对羊毛细化具有效果的菌株,又通过摇瓶复筛出一株对羊毛细化具有明显效果的菌株并命名为DH-CAO,同时设计了一种以羊毛作为底物的酶活力测定方法,用此法筛选出的菌株的最高产酶活力可以达到620 μg/mL。其他的单一化学诱变剂在霉菌中很少有看到报道,主要是和其他诱变方法组成复合诱变方法。
3 物理化学复合诱变
多种物理诱变方法和多种化学诱变方法结合使用,在霉菌中为了得到高产菌株产生了很好的效果。特别是物理诱变方法紫外线和化学诱变方法氯化锂相结合运用较多,并且提高倍数较大[34-37]。赵炎生等[38]采用激光和氯化锂复合诱变赤霉菌,复合诱变提高达189.6%。徐丽等[39]应用60Co γ射线照射并结合甲硫氛酸筛选模型和5-氟尿喀吮筛选模型诱变对出发菌株阿维链霉菌H20-16进行诱变处理,获得发酵单位提高的菌株Co39-15和CF(20)-39-61比出发菌株分别提高了173.3%、76.5%。陈红歌等[40]以黑曲霉MAO2 1为出发菌株,经紫外线、亚硝基胍单独处理和复合处理,获得一株植酸酶高产菌株UN-12-10是原始菌株的3.6倍。林剑等[41]对琥珀酸产生菌S-1进行紫外线亚硝基胍的复合诱变后,筛选出琥珀酸产量高,在运用激光诱变,得出高产菌株相对于未诱变的菌株产量提高了343倍。方春玉等[42]以紫红红曲霉为出发菌株,通过物理(紫外线、超声波、微波)诱变和化学(氮化铿)诱变的方法来选育红曲色素高产菌株,紫外和超声波复合诱变的方法产红曲色素的色价为922 U/mL,比出发菌株产红曲色素的能力提高了约3倍。魏培莲等[43]红曲霉出发菌株经紫外线,硫酸二乙酯,氯化锂等诱变剂反复诱变处理,诱变株M7的含量比出发菌株相比提高了41倍。杨劲松[44]采用紫外线(UV),激光(Laser),亚硝基孤(NTG)复合诱变HN89青霉后,效价提高了100%以上的菌株为9株,占13%,其中突变株HN89-68活性物质的相对效价可提高到286%。
各种物理诱变方法和化学方法结合的常被运用到,常常是一种物理诱变方法和一种化学诱变方法结合,也有运用多种物理诱变方法和一种或多种化学诱变方法结合,或者一种处理方法多次重复使用来达到高产的目的,其中最常运用到的物理方法有紫外线、激光、微波、60Co γ射线等,最长运用到的化学方法有氯化锂、亚硝基胍、亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等。
4 总结
在霉菌诱变方法中,物理方法比较多,并且相对于化学方法来说较安全、简单,并且不会产生很多的有害物质对突变株的影响。在物理诱变方法中,新技术离子注入方法取得了很好的突破,提高了的倍数都比较大,并且适当的结合化学诱变剂,也能够取得很不错的突变效果。今后发展新的物理技术运用到霉菌微生物诱变中,会有很不错的发展前景。
[1]Yan Tao.The research of the mutafacient hericium erinaceus poured by the nitrogen ion beam[J].Food industry science and technology, 2007,21(3):11-17
[2]Chen Hao,Liang Yun-zhang.The using of Ion beam biological technology at Medicinal plant breeding[J].Chinese Medicine Magazine, 2005,5(5):41-43
[3]郭继平,马莺.紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株[J].微生物学通报,2007,34(2):246-250
[4]陈亚光,高朝辉,陈勇,等.沪酿3.042米曲霉紫外诱变及高活力蛋白酶菌株选育[J].中国调味品,2005,3(3):15-18
[5]屈二军,索向阳,赵桢,等.高产纤维素酶的黑曲霉菌种的选育[J].安徽农业科学,2008,36(24):10303-10304
[6]郭鲁宏,杨顺楷.黑曲霉单宁酶高活性菌株的诱变选育[J].微生物学通报,2000,27(2):105-108
[7]周长海,于洪梅,王淑杰,等.粟米酱米曲霉菌的紫外线诱变及优良菌种的选育[J].中国酿造,2006,11(20):24-27
[8]陈建爱,王未名.辐照木霉菌株的生物学效应研究[J].核农学报, 2003,17(1):16-19
[9]杨平平,王燕,陶文沂,等.60Co γ射线诱变黑曲霉菌株产植酸酶的研究[J].核农学报,2004,18(3):193-196
[10]梁新乐,陈敏,张虹,等.60Co γ射线诱变阿维拉霉素筛选高产菌株及培养基优化[J].核农学报2007,21(5):451-455
[11]宋安东,苏丽娟,谢慧,等.γ射线对斜卧青霉的诱变筛选及产酶条件优化[J].核农学报,2008,22(3):280-285
[12]胡燕红,姜绍通,罗水忠,等.米根霉产L-乳酸耐温菌株的60Coγ射线诱变选育[J].食品科学,2008,29(12):452-456
[13]Rikimaru H.High pressure in bioscience and biotechnology:pure science encompassed in pursuit of value[J].Biochemical et Bio-physical Acta,2002,1595(1):397-399
[14]Bartlett D H.Pressure effects on in vivo microbial processes[J].Biochemical et Biophysical Acta,2002,1595(1):367-381
[15]王岁楼,吴晓宗,郝丽花,等.超高压在工业微生物诱变选育中的应用初探[J].中国生物工程杂志,2005,25(6):7-9
[16]van Breugel H,Bar PRD.Power density and exposure time of He-Ne laser irradiation are more important total energy dose in photobiomodulation of human fibroblasts in vitro[J].Lasers in Surgery and Medicine,1992,12(1):528-537
[17]Femandez RO,Pizarro RA.Pseudomonas aeruginosa.UV-A-induced lethal effece:influence of salts,nutritional stress and pyocyanine[J].Photochem Photobiol B:Biol,1999,50(1):59-65
[18]李俊刚,方善康.激光诱变黑曲霉原生质体选育高酶活生淀粉糖化菌的研究[J].微生物学通报,1993,20(4):213-215
[19]彭益强,吕凤萍,贺淹才,等.激光诱变筛选高产植酸酶黑曲霉菌株的研究[J].激光生物学报,2012,11(6):434-437
[20]曹小红,杜冰冰,鲁梅芳.N十离子束注入米曲霉诱变效应的研究[J].中国食品学报,2005,5(4):128-132
[21]庞锐,潘丽军,姜绍通,等.N+注入诱变选育混合糖发酵L-乳酸高产菌株[J].食品科学,2010,31(21):248-253
[22]古绍彬,葛春梅,汪青宏,等.产L-乳酸米根霉PW352特性及低能离子注入诱变高产菌株研究[J].工业微生物,2004,34(1):12-16
[23]龚加顺,刘勤晋,肖琳,等.单宁酸酶产生菌氮离子注人的诱变效应研究[J].食品与发酵工业,2000,26(5):9-13
[24]宫春波,刘鹭,谢丽源,等.离子注入微生物诱变育种研究进展[J].生物技术,2003,13(2):47-49
[25]刘连碧,朱春宝,珠宝泉.离子注入诱变育种技术在柔红霉素高产菌选育中的应用[J].中国医药工业杂志,2001,32(7):297-299
[26]桑金隆,竺莉红,李孝辉,等.离子注入诱变选育之江菌素产生菌[J].科技通报,2002,18(1):63-66
[27]邵淑娟,李铁柱,李倬林,等.产凝乳酶黑曲霉JG的微波诱变育种研究[J].中国酿造,2010,7(1):47-50
[28]李永泉.微波诱变选育木聚糖酶高产菌[J].微波学报,2001,17(1):50-53
[29]杨胜利,王金宇,杨海麟,等.超声波对红曲菌的诱变筛选及发酵过程在线处理[J].微生物学通报,2004,31(1):45-49
[30]赵兴秀,方春玉,周健,等.紫外线与超声波复合诱变选育红曲色素高产菌株的研究[J].中国酿造,2010,216(3):66-69
[31]印红,谢申义,章光明,等.利用返回式飞船选育优良红曲霉菌[J].核农学报,2004,18(4):297-299
[32]王希季,林华宝,苏连风.中国返回式卫星的搭载任务,空间生命科学试验[J].中国空间科学技术,1995(4):29-36
[33]张同亮,张扬,缪翔,等.亚硝基胍诱变选育酸性蛋白酶产生菌[J].四川纺织科技,2004,4(1):4-7
[34]闵伟红,李佳,王影,等.产纤溶酶霉菌的筛选及诱变[J].食品科学, 2007,28(6):226-229
[35]李平,宛晓春,陶文沂,等.复合诱变黑曲霉选育β-葡萄糖苷酶高产菌株[J].菌物学报,2000,19(1):117-121
[36]王伟平,吴思方.复合诱变红曲霉选育红色素高产菌株[J].湖业工学院学报,2003,18(4):5-9
[37]卢燕云,林建国,李明.复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株[J].中国酿造,2009,202(1):49-51
[38]赵炎生,肖灿鹏,苏宝亮,等.赤霉素产生菌的激光、化学复合诱变育种研究[J].激光生物学报,1997,12(1):1-7
[39]徐丽,张怡轩,王勇,等.Co60γ射线照射技术在阿维菌素产生菌诱变育种中的应用[J].安徽农业科学,2007,35(13):3797-3799
[40]陈红歌,苗雪霞,张世敏,等.植酸酶高产菌株的诱变选育[J].微生物学通报,1997,24(5):272-274
[41]林剑,孙莹,刘晓艳,等.琥珀酸产生菌的诱变与选育[J].食品科学, 2007,28(12):309-312
[42]方春玉,周健,邓静,等.高产红曲色素的紫红红曲霉诱变育种技术研究[J].中国酿造,2008,200(23):19-22
[43]魏培莲,周立平,毛建卫.高产降胆固醇活性物质的红曲霉菌种选育研究[J].氨基酸和生物资源,2002,24(3):18-22
[44]杨劲松,李斌,陈文学,等.海洋青霉菌抗真菌活性物质高产菌株的诱变选育[J].热带作物学报,2003,24(2):77-80
The Application of Mutation Breeding Method in the Mould
XIONG Jin,HUANG Kui-ying,CAO Ding,GAN Xiang-wu,CHEN Qiong
(Guangzhou Institute of Microbiology,Guangzhou 510663,Guangdong,China)
The research progress of mutagenic breeding methods in mold was introduced.The effects of physical mutation,chemical mutation and physical-chemical compound mutation were introduced.Research showed that,physical mutation methods were more widely used than chemical methods,the use of physical mutation and the appropriate combination of chemical mutation also achieved good results.
mutagenesis;mold;physical mutation;chemical mutation
10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.045
2017-01-17
广东省省级科技计划项目(2016B090918055);广州市科技计划项目(201705040004)
熊进(1989—),男(汉),助理工程师,硕士,研究方向:食品生物技术。