Prox-1与Ki-67在原发性胆囊癌中的表达及意义

向 佳，汤建国，吕 品，柳 志

（湖南师范大学附属湘东医院，醴陵 412200）

Prox-1与Ki-67在原发性胆囊癌中的表达及意义

向 佳，汤建国，吕 品，柳 志

（湖南师范大学附属湘东医院，醴陵 412200）

目的：探讨Prox-1与Ki-67在原发性胆囊癌癌组织中的表达及临床意义。方法：用免疫组化法检测原发性胆囊癌患者癌组织、胆囊良性病变患者胆囊组织中Prox-1及Ki-67的表达，比较两种蛋白表达的差异，并分析Prox-1及Ki-67的表达与胆囊癌患者临床病理因素和预后的关系。结果：转移组的胆囊癌组织中Prox-1表达阳性率明显高于无转移组的和对照组；无转移组Prox-1表达阳性率与对照组比较差异无统计学意义。转移组的胆囊癌组织中Ki-67表达阳性率和无转移组比较无明显差异；转移组和无转移组Ki-67表达阳性率明显高于对照组。两种蛋白的表达与患者的性别、年龄无明显关系；胆囊癌组织中Prox-1与Ki-67表达相关性不明显。结论：原发性胆囊癌患者胆囊癌组织中Prox-1和Ki-67的阳性表达率明显增高，且Prox-1的表达强度与分化程度及淋巴结转移有关。Prox-1参与了胆囊癌的发生、发展，对胆囊癌患者的预后评估具有重要意义。

胆囊癌；Prox-1；Ki-67抗原；淋巴结转移

胆囊癌（carcinoma of gallbladder）是一种恶性程度很高的消化道系统肿瘤，在胆道肿瘤中其发病率居首位［1］，早期诊断困难，根治性手术切除率低，预后差。胆囊癌以腺癌居多，淋巴转移是胆囊癌的主要转移途径，肿瘤淋巴结转移是重要的预后指标［2］，研究胆囊癌转移与淋巴管生成的作用有助于寻找抗肿瘤治疗的新靶点。果蝇prospero同源异形盒蛋白1（prospero homeobox protein 1，prox-1）是淋巴管发育所不可缺少的因子［3］。Prox-1是目前淋巴内皮细胞最具特异的谱系标记物，在成年人组织和肿瘤中仅在淋巴管表达［4］。细胞增殖标志物Ki-67，已被广泛地应用肿瘤细胞增殖活性检测，Ki-67 的表达是评价肿瘤增殖活性的既定的方法［5］。本研究将应用免疫组织化学方法检测胆囊癌组织以及良性病变胆囊组织中Prox-1蛋白和Ki-67的表达，并分析其表达水平与临床病理特征以及淋巴结转移的相关性；分析Ki-67与Prox-1表达是否存在相关性及其在判断胆囊癌淋巴管增生中的价值；分析它们的表达水平与患者预后的关系，为胆囊癌治疗和预后评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集湖南省人民医院自2008年6月～2012年6月胆囊癌手术切除的癌组织35例和胆囊良性疾病手术切除（如胆囊结石胆囊炎）的胆囊组织标本17例。胆囊癌中伴有淋巴结转移者20例，将其作为A组；无淋巴结转移者15例，作为B组。患者年龄49～81岁，中位年龄66岁，所有肿瘤患者在手术前均未进行过任何放疗及化疗，同时排除心血管疾病及糖尿病病史。胆囊癌手术切除的癌组织，制作石蜡标本用于免疫组化及临床病理统计，采用WHO的最新组织学分级的临床分期标准对所有胆囊癌患者进行分析。将胆囊良性疾病手术切除的患者作为对照组（C组）。

1.2 免疫组化检测Prox-1与Ki-67的表达

1.2.1 主要试剂 Santa Cruz公司的兔抗人Prox-1多克隆抗体，福州迈新公司的抗Ki-67单克隆抗体，试剂盒和显色试剂盒购自美国DAKO公司。

1.2.2 实验方法 石蜡切片，每例病理标本均作5μm厚的连续切片，进行HE染色和免疫组化染色。检测Prox-1、Ki-67蛋白在组织中的表达。操作按照免疫组化SP法进行，检测两种因子表达（Prox-1的工作浓度为1：150；Ki-67的工作浓度为1：150）。以缓冲液代替一抗作阴性对照。Prox-1、Ki-67均采用微波法进行抗原修复。

1.2.3 结果判定 参考吕品等［6］10］的评定标准，于光学显微镜下观察染色结果，Prox-1因子表达为细胞质内浅黄色至棕黄色颗粒；Ki-67因子表达为细胞核内浅黄色至棕黄色颗粒。染色结果采用半定量积分标准：染色强度和阳性细胞率两项评分指标相乘。首先以细胞着色强度评分标准：无着色者为0分，浅黄色者为1分，棕黄色者为2分，棕褐色者为3分。再计算阳性细胞率：先低倍镜下观察找到着色胆囊癌上皮区域；再在高倍镜下观察阳性细胞数占整格肿瘤细胞的百分数比例（每张切片随机选择10个不重叠的视野，每格高倍镜视野计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，并计算平均值）。具体分组如下：阳性细胞数＜5%计为0分，阳性细胞数6%～20%为1分，阳性细胞数21%～50%为2分，阳性细胞数51%～75%为3分，阳性细胞数＞75%为4分。最后根据上述两者所得评分相乘，所得积分为4个级别，0分记“-”阴性，1～4分记+为弱阳性，5～8分记++为阳性，9～12分以上则记+++为强阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，计数资料分析采用χ2检验、等级资料的相关性分析采用Spearman等级相关检验，利用Kaplan-Meier法检测累积生存率并绘制生存率曲线，Log-rank比较生存率差异，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组 PROX-1、Ki-67表达结果比较 显微镜下胆囊癌组织中Prox-1阳性表达呈棕黄色，主要定位于细胞质；Ki-67阳性表达主要位于细胞核内。

由表1可见，转移组的胆囊癌组织中Prox-1表达阳性率为85%，明显高于无转移组的33.3%和对照组的23.5%（P＜0.05）；无转移组Prox-1表达阳性率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。转移组的胆囊癌组织中Ki-67表达阳性率为95%和无转移组的80.0%比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；转移组和无转移组Ki-67表达阳性率明显高于对照组18.3%（P＜0.05）。

表1 各组Prox-1与Ki-67表达情况

2.2 胆囊癌组织中Prox-1与Ki-67表达的相关性

表2结果可见，原发性胆囊癌组织标本中Prox-1与Ki-67的表达无明显相关性（P＞0.05）。

表2 胆囊癌组织中Prox-1与Ki-67表达的相关性分析

2.3 胆囊癌组织标本中Prox-1与Ki-67的表达与临床病理特征的关系 Prox-1与Ki-67在胆囊癌组织中表达与患者的性别、年龄均无关（P＞0.05）。胆囊癌标本分化程度越低，恶性程度越高，两者的表达均与胆囊癌细胞的分化程度有关（P＜0.05）。

2.4 胆囊癌患者生存分析 采用电话等随访本研究中胆囊癌患者的生存情况。胆囊癌患者的平均生存时间为22个月，中位生存时间为16个月。生存分析显示，生存率在Prox-1阳性表达者与阴性表达者之间存在明显差异，即阳性表达生存率明显低于阴性表达者（P＜0.05），而生存率在Ki-67阳性表达者与阴性表达者之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 Prox-1与Ki-67的表达与胆囊癌相关临床病理因素的关系

图3 不同Prox-1与Ki-67表达状态患者生存率的比较A. Prox-1阳性与阴性表达患者比较；B. Ki-67阳性与阴性表达患者比较

3 讨论

目前普遍认为，恶性肿瘤的淋巴结转移并不仅仅是单个基因突变的结果，而是由多个基因共同作用的结果，肿瘤细胞和淋巴内皮细胞及相应的细胞外基质之间复杂和多步骤相互作用的过程导致了肿瘤的淋巴结转移，因此，淋巴管生成是肿瘤发生淋巴结转移过程中的重要事件，肿瘤诱发淋巴管生成的分子机制和以淋巴管生成作为抗肿瘤转移靶点的研究是当前的研究热点，淋巴转移作为胆囊癌转移的主要途径，影响胆囊癌手术切除患者预后，无淋巴结转移的胆囊癌患者生存率明显高于有淋巴结转移者［7］。

在本实验中Prox-1在原发性胆囊癌患者胆囊癌组织中的表达显著增高，并与分化程度相关。有淋巴结转移的胆囊癌癌旁组织Prox-1表达显著高于无淋巴结转移的胆囊癌组织，但无论有无淋巴结转移均与患者的年龄和性别无关。这些研究表明在人原发性胆囊癌中，Prox-1表达增高与肿瘤淋巴结转移有关。既往的研究发现［8］，在肝癌组织中Prox-1因子呈过表达，剔除Prox-1基因的肝癌细胞的侵袭和增殖能力显著下降，Prox-1参与肝癌细胞转移，Prox-1在肝内胆管癌细胞中表达显著增高，乳腺癌中Prox-1高表达提示已发生淋巴结转移，LYVE-1和Prox-1在非小细胞性肺癌中评估淋巴结转移及评价患者的预后具有重要作用［9］。转录因子 PROX1 已被证明是在结直肠肿瘤恶性转化和进展Wnt/β-catenin/TCF 通路下游目标［10］。此外，Prox-1还在中枢神经系统、晶状体、肝、 胰腺、淋巴系统和心的发展中起着关键作用［11］。

Ki-67是一种存在于增殖细胞核与细胞增殖密切相关的核蛋白，表达于肿瘤细胞核内，除了在细胞周期的G0 期外所有阶段均有表达［12］。通过 Ki-67 或MIB-1抗体的免疫组织化学（IHC）检测，现已作为肿瘤细胞增殖主要相关因素被广泛应用。研究表明［13］Ki-67 已在各种恶性肿瘤，如胰腺神经内分泌肿瘤的预后价值。此外，有已经证明 Ki-67 与侵略性肿瘤，包括前列腺癌、星形细胞瘤、后胃肠胰腺神经内分泌肿瘤、肺癌、乳腺癌和垂体腺瘤等密切相关的研究［14］。

本研究通过免疫组化实验研究，从蛋白水平检测Prox-1与Ki-67在不同胆囊组织中存在不同的表达情况，表明Prox-1与Ki-67在胆囊癌的发生发展过程中起着非常重要的作用。胆囊癌组织中Prox-1与Ki-67两种因子表达相关性不大，与吕品等［6］在胆管癌中的研究有不同点，这可能与本实验的样本量较少及取材部位有关，这需要加大样本量及进一步的相关研究证实。通过原发性胆囊癌患者两种因子与临床病理因素联系的分析可得出这样的结果：Prox-1的表达与胆囊癌的分化程度、淋巴转移有关，与患者的性别、年龄无关，而Ki-67的表达与胆囊癌分化程度有关，与上述其他因素均无关；Prox-1阳性表达患者的生存率明显低于Prox-1阴性表达患者，有统计学意义，而生存率在Ki-67阳性表达患者与阴性表达患者之间差异无统计学意义，由此可知Prox-1表达阳性的患者因分化程度低，其恶性程度较高，易发生淋巴转移，预后较差，Ki-67的表达不参与胆囊癌的淋巴转移，与患者预后关系不显著。

综上所述，胆囊癌患者病变胆囊癌组织Prox-1和Ki-67的阳性表达率显著高于对照组，且Prox-1的表达强度与分化程度及淋巴结转移有关。胆囊癌患者中Prox-1蛋白表达与Ki-67蛋白表达相关性不明显，研究表明Prox-1参与了胆囊癌的发生、发展，对胆囊癌的预后评估具有重要意义。对评估原发性胆囊癌的浸润转移和预后，制定相应的治疗方案提供重要的实验依据。

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Expressions of prox-1 and ki-67 in primary gallbladder carcinoma and their significance

Xiang Jia, Tang Jia-guo, Lv Pin, Liu Zhi
(Xiangdong Hospital Affiliated to Hunan Normal University, Liling 412200, China)

Objective To investigate the Prox-1 and Ki-67 expressions in primary gallbladder carcinoma tissues and their clinical significance. Methods The Prox-1 and Ki-67 expressions in cancer tissues from patients with primary gallbladder cancer and gallbladder tissues from gallbladder benign lesions patients were determined by immunohistochemical stain-ing. The difference in expressions of two proteins among the tissues was compared and their relations of Prox-1 and Ki-67 expressions with clinicopathologic factors and prognosis of gallbladder cancer patients were analyzed. Results The expressions of Prox-1 in gallbladder carcinoma tissue with lymph node metastases was significantly higher benign lesions of gallbladder tissue and without lymph node metastases of gallbladder carcinoma tissue. There was no significant difference compared with the without metastasisand the control group expression of Prox-1 positive rates. The expression of Ki-67 inmetastasis of gallbladder cancer issue and metastasis-free groups had no significant differences; but metastasis and metastasis-free of Ki-67 positive expression rates significantly higher than the control group. Two kinds of protein expression were notassociated with sex and age of the patients; there was a not obvious correlation between Prox-1 and Ki-67 expression in carcinoma of the gallbladder. Conclusion Both Prox-1 and Ki-67 positive rates in gallbladder carcinoma tissues of primary gallbladder carcinoma patients were significantly higher, and expression of Prox-1 was associated with the degree of differentiation and lymph node metastases. Prox-1 participate in the process of occurrence and development of Carcinoma of gallbladder, has very important significance for prognosis of gallbladder cancer patients.

gallbladder carcinoma; Prox-1; Ki-67 antigen; lymph node metastasis

R735.8

A

1673-016X（2017）01-0007-04

2017-01-03

汤建国，E-mail：18573104516@163.com