突变酶Y93S对嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶热稳定性的影响

韦阳道，易弋*，黎娅，石征宇，伍时华，梁建荣

突变酶Y93S对嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶热稳定性的影响

韦阳道1，2，3，易弋1，2，3*，黎娅1，2，3，石征宇1，2，3，伍时华1，2，3，梁建荣4

（1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州545006；3.广西高校糖资源加工重点实验室，广西柳州545006；4.柳州市鱼家乐饲料有限公司，广西柳州545002）

为提高嗜热地衣芽孢杆菌SR01葡聚糖酶的热稳定性，对其相关的氨基酸残基进行定点突变改造。通过对其结构的分析，构建了Y93S突变体，利用分子动力学模拟分析评估后，发现Y93S突变体可能具有较高的耐热能力，利用定点突变技术构建Y93S表达载体并分析温度对表达产物酶活的影响。试验结果表明，突变酶Y93S的最适温度由野生型酶的55℃提高至70℃；在90℃条件下，突变酶Y93S较野生型酶的半衰期由60 min提高到120 min以上；pH及pH稳定性较野生型变化不明显。突变酶Y93S极大的提高了野生型酶的热稳定性，具有潜在的工业应用价值，同时为葡聚糖酶的耐热机理提供有力依据。

分子动力学；嗜热地衣芽孢杆菌；葡聚糖酶；热稳定性

嗜热酶以其独特的特性，成为目前研究的热点，然而大多数的酶不具有耐高温的特性，因此其发展受到阻碍。决定嗜热酶热稳定性的主要机制是蛋白质的热稳定性[1]。蛋白质在氨基酸顺序排列成一级结构的基础上，通过疏水作用、氢键、盐键和静电作用等次级键再折叠成对活力发挥关键作用的二、三级结构。蛋白质空间构象上的微妙差异和外界微环境的影响，使得嗜热酶表现出比常温酶更强的热稳定性，更有利于其在高温条件下发挥催化功能。在蛋白质一级结构研究中，通过嗜热菌和常温菌蛋白质氨基酸组成的比较，发现嗜热菌蛋白质中Ala、Pro、Arg、Glu的含量均高于常温菌，而Asn、Gln、Trp、Val、Ile的含量显著低于常温菌[2]。可能是因为Ala氨基酸易于形成螺旋结构，可以增强蛋白质分子结构的刚性[3]；Arg氨基酸残基具有较大的侧链易于提供疏水作用及离子间相互作用[4]；Asn与Glu氨基酸残基在高温下会发生脱氨基作用，造成酶分子结构不稳定进而不能发挥其生物活性等[5]。有研究表明，通过定点突变有助提高酶的热稳定性，如STEWART R J等[6]通过对大麦葡聚糖酶定点突变构造K23R、M298K/T17D突变体，其突变体和亲本酶H300P相比，热稳定性有着显著的提高；KIM S A等[7]通过对葡聚糖酶分子结构中的第70位的Asp氨基酸突变为Val氨基酸获得突变体2011D，其半衰期从52℃、10 min提高至66℃、10 min；PONS J等[8]通过构建突变体N57A，发现其耐热性要高于野生酶。由于试验筛选工作量较大，随着分子模拟技术的发展，可以极大的解决这一问题。分子模拟是指利用理论方法与计算技术，模拟或仿真分子运动的微观行为，被广泛的应用到计算化学、计算生物学和材料科学等领域。特别对于复杂的生物体系的研究是当前研究的热点。由于其具有较高的准确性，因此被作为真实试验的辅助工具。如詹冬玲等[9]为提高嗜热蛋白酶PhpI的活力，通过分子对接与分子动力学模拟，最终获得突变体K43C可能有利于提高酶活力，通过分子生物学的试验得到验证，其水解丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-7-氨基-香豆素（AAF-AMC）的活力是野生酶的5.8倍。

本实验在前期研究获得葡聚糖酶的基因序列的基础上，通过理性设计的方法，即利用分子动力学模拟获得可能具有耐热性好的突变体，并通过重叠聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术获得突变体进行验证。本研究可以极大的提高试验的效率，同时为葡聚糖酶结构的热稳定机制的进一步的研究提供了有利的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

表达载体pGEX-4T-3、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21：由广西科技大学发酵工程研究实验室提供；载体pMD18-T、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoRI和BamHI、DL5000DNA Marker：大连宝生物工程有限公司；引物由上海英俊生物技术有限公司合成；葡聚糖：北京索莱宝科技有限公司；质粒提取试剂盒、凝胶DNA回收试剂盒：北京天根生化科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1100紫外/可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；ZFD-5250全自动新型鼓风干燥箱、HWY-2112全温度恒温调速摇床柜：上海智城分析仪器制造有限公司；Micro 220R台式冷冻离心机：德国HETTICH公司；LRH-250生化培养箱：广东省医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 获得3维结构

通过利用网络服务器I-TASSER（http：//zhanglab.ccmb. med.umich.edu/I-TASSER/）对嗜热地衣芽孢杆菌葡聚糖酶（登录号：YP_006712752.1）进行同源建模，通过GROMACS 4.6.5软件对其进行能量优化，获得合理的结构。同时利用Deepview软件对目标位点进行突变，通过能量优化，获得突变体3维结构。

1.3.2 分子动力学模拟

本研究采用GROMACS4.6.5软件进行分子动力学模拟[10]，水分子采用统计过程控制（statistical process control，SPC）模型[11]，力场选择OPLS-AA/L全原子力场[12]，范德华作用利用Lenard-Jones函数计算，非键截断距离为1.4nm[13]，非键作用原子列表每2个步长更新一次，长程静电相互作用利用PME方法进行计算[14]，在计算过程中采用周期性边界条件，消除边界条件。将蛋白质置于距离立方体边缘1.0 nm的盒子中，并中和电荷，使其处于中性的环境中，在能量优化后，使用约束动力学的方法，进行800 ps的等温等压体系的平衡，温度应分别达到为323 K、343 K和363 K，通过V-rescale方法控制温度，采用Berendsen方法控制压力，压力为1个大气压，温度和压力耦合时间常数均为0.1 ps[15]。平衡后进行20 ns自由动力学模拟，每2 ps采集一次构象。模拟完成后通过对均方根偏差、均方根涨落和回旋半径等参数的分析来研究突变体热稳定性的变化。

1.3.3 构建表达载体，获得重组蛋白

（1）原核表达载体构建

根据重叠PCR的原理，设计出四条引物，分别为LG1s：GGATCCGCCTTGGTCTGCCTCTATG，LG1a：GAATTC TACATCATCGCTATTACGC，S1：ATTTCAGCCCTGTGC GGGAGCCTGG，A1：CCAGGCTCCCGCACAGGGCTGA AAT，均有上海英俊有限公司合成。以野生型葡聚糖酶DNA为模板，分别以LG1s和A1、LG1a和S1为引物进行PCR，纯化所得DNA，合并作为下一步模板，用LG1s和LG1a为引物进行PCR，纯化PCR产物，通过T-A克隆连接到pMD-18T中，转化BL21鉴定测序。将测序正确的TA克隆重组菌于37℃条件下培养16 h后提取质粒，后将限制性内切酶EcoiI、BamHI进行双酶切，胶回收后的目的基因片段通过T4DNA连接酶与表达载体pGEX-4T-3相连接，构建出重组表达载体，根据双酶切与PCR验证后，选择可能的重组菌测序，最终由测序结果判断是否符合本实验的要求。

（2）获得重组蛋白

取经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导后的菌液500 mL，4 000 r/min离心15 min，去上清，并用pH7.4的磷酸钾缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤1次，然后置于25mL的PBS溶液中，利用超声波细胞破碎仪（100 W工作2 s，间歇2 s）破碎菌体30 min。将破碎后的液体经4 000 r/min离心15 min，收集上清液，即为粗酶液。

1.3.4 酶的最适温度及温度稳定性

采用二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[16]检测葡聚糖酶的活力，将重组的突变体分别置于30～90℃条件下进行酶促反应，以最适温度条件下的酶活为100%，使用相对酶活比较各温度条件下的酶活力大小。将酶液置于50℃、70℃和90℃条件下分别处理30 min、60 min、90 min和120 min，并于最适温度下测定剩余酶活，以未处理的酶活为100%。

1.3.5 酶最适pH及pH稳定性

分别以pH3～10的缓冲液配制3 mg/mL的葡聚糖底物，于最适温度条件下测定其相对酶活，以最高酶活为100%。将pH3～10的不同缓冲液与酶液按1∶1混合，4℃分别放置1、2 h，并于最适温度条件下测定剩余酶活，以未处理的原酶液的酶活作为100%。

2 结果与分析

2.1 均方根偏差分析

均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）是指蛋白质分子空间结构在模拟过程中的动态变化，其值越小，说明蛋白质的稳定性就越高[17]。野生型与突变体Y93S蛋白的分子动力学模拟结果如图1所示。

图1 野生型蛋白与突变体Y93S蛋白在323 K(A)、343 K(B)、363 K(C)条件下的RMSD值Fig.1 RMSD values of wild-type protein and mutant Y93S at 323 K (A),343 K(B)and 363 K(C)conditions

由图1可知，在相同的温度条件下，野生型蛋白的RMSD值要高于突变体Y93S，同时可以看出，野生型与Y93S蛋白体系随着时间的延长，也都逐渐趋于平衡；在不同的温度条件下，野生型蛋白和Y93S蛋白的RMSD值随着温度的升高而增加，但Y93S蛋白的RMSD值较野生型增加的幅度较小，这说明，突变体Y93S蛋白结构较野生型更加稳定。

2.2 回旋半径分析

回旋半径（radius of gyration，Rg）可以用作形容蛋白质结构的紧密度，如图2所示。由图2可知，在相同的温度条件下，野生型的Rg值要略高于突变体Y93S，其中在323K温度下，野生型蛋白的Rg值主要分布在1.69～1.73 nm范围内，并且集中在1.71 nm，而Y93S蛋白的Rg值主要分布在1.68～1.72nm范围内，集中于1.71nm；在343K温度下，野生型的Rg值主要分布在1.70～1.73nm范围内，集中于1.72 nm左右，而Y93S的Rg值主要分布在1.69～1.72 nm范围内，集中于1.71 nm；在363 K温度下，野生型的Rg值分布在1.70～1.74 nm范围内，集中于1.72 nm附近，而Y93S蛋白的Rg值主要分布在1.69～1.72 nm范围，集中于1.71 nm。并且在不同的温度条件下，可以看出随着温度的升高，Rg值呈上升趋势，然而突变体Y93S蛋白较野生型蛋白的Rg值在随温度的升高，变化不明显，这说明在高温条件下，Y93S蛋白整体结构较为稳定，可以更好的适应高温环境。

图2 野生型蛋白与突变体Y93S蛋白在323 K(A)、343 K(B)、363 K(C)条件下的Rg值Fig.2 Rg values of wild type-protein and mutant Y93S at 323 K(A), 343 K(B)and 363 K(C)conditions

2.3 其他因素分析

影响酶的热稳定性的因素有很多，如盐键的数目、氢键和静电相互作用等，本研究通过分别计算溶剂可及表面、盐桥、氢键、库仑力等方面的平均值来考察突变体Y93S与野生型蛋白在不同温度下的热稳定性的影响，试验结果如表1所示。

表1 突变体Y93S与野生型在不同温度下各参数比较Table 1 Comparison of the parameters of the mutant Y93S and the wild-type at different temperatures

由表1可知，在323 K和343 K温度条件下，突变体Y93S蛋白与野生型蛋白的总溶剂可及表面积相差较小，在363 K的温度条件下，两者相差略大，差值为1.23 nm2。在不同的温度下，随着温度的增加，野生型蛋白的总溶剂可及表面有逐渐增加的趋势，而突变体Y93S蛋白没有变化，这说明在高温下，突变体整体结构较野生型稳定；盐桥的数目随着温度的增加有上升的趋势，这可能是由于温度的升高破坏了蛋白质内部结构之间的作用力，使得其自身通过形成更多的盐桥来维持自身在高温环境下的稳定。野生型蛋白质分子间的氢键与蛋白质与水分子之间的氢键随着温度增加而降低，而蛋白质分子间的氢键数目变化没有规律。从库仑力、势能和总能量可以看出，野生型相比Y93S的数值相差较大，这可能是与突变后的氨基酸残基有关，增加了分子间作用力，使得结构变的更稳定。

针对原州区水利建设的实际情况，应该坚持统筹兼顾、因地制宜的原则，实现对本地区的全面统筹规划。标准化、制度化是对农田水利建设工作人员的要求，也是对农田水利工程建设结果的保障。从工程建设到工程运营和维护，都要严格规范管理，以提高原州区农田水利现代化建设水平。

2.4 酶的最适温度及温度稳定性

2.4.1 酶的最适温度

图3 野生型蛋白与突变体Y93S的最适温度Fig.3 Optimum temperature of the wild-type protein and the mutant Y93S

由图3可知，野生型蛋白与突变体Y93S蛋白的酶活力随着温度的升高呈现先升高后降低的趋势，其中野生型蛋白的最适温度为55℃，而Y93S蛋白的最适温度为70℃，较

野生型蛋白提高了15℃。

2.4.2 酶的温度稳定性

图4 野生型蛋白与突变体Y93S蛋白在50℃（A）、70℃（B）、90℃（C）条件下的温度稳定性Fig.4 Temperature stability of wild-type protein and mutant Y93S at the condition of 50℃(A),70℃(B)and 90℃(C)

将野生型与突变体Y93S蛋白分别放于50℃、70℃和90℃条件下处理一段时间后，置于最适温度条件下进行酶促反应，结果如图4所示。

由图4可知，在相同的温度下，突变体Y93S蛋白较野生型蛋白具有更高的酶活力。在50℃下，Y93S处理120min仍有95%的酶活力，而野生型蛋白处理120 min，其酶活力下降至85%左右；在70℃下，Y93S蛋白处理90 min仍有95%的酶活力，野生型蛋白处理90min后，剩余酶活约为80%；在90℃下，Y93S与野生型蛋白随着时间的增加，其剩余酶活也逐渐下降，在处理120 min时，Y93S的剩余酶活仍有60%，而野生型蛋白的剩余酶活在40%左右。在不同的温度下，Y93S与野生型蛋白的剩余酶活随着温度的升高而下降，而突变体Y93S蛋白的下降幅度较野生型较小。同时也可以看出，将野生型蛋白在90℃条件下的半衰期从60min提高至120 min以上，因此可以得出，突变体Y93S蛋白的耐热性较野生型蛋白提高。

2.5 酶的最适pH及pH稳定性

2.5.1 酶的最适pH

图5 野生型蛋白与突变体Y93S蛋白的最适pHFig.5 Optimum pH of wild-type protein and mutant Y93S

由图5可知，突变体Y93S与野生型蛋白的酶活随着pH值的增加呈现先增加后降低的趋势，最适pH值都为6，这可能是突变后的S93氨基酸残基与Y93的酸碱性相似，因而不会引起酶的最适pH值得变化。

2.5.2 酶的pH稳定性

将野生型与突变体分别在pH 3～10的缓冲液中进行酶促反应1 h、2 h，测定酶活力，结果见图6。

由图6可知，突变体Y93S与野生型蛋白在处理1h与2h，两者的变化不大，在pH5～8范围内，两者的剩余酶活都达到80%以上，而在pH≤5时，两者的剩余酶活都在75%左右，在pH＞8以后，突变体Y93S蛋白呈下降的趋势，而野生型蛋白下降不明显，趋于平衡。因此两者的pH稳定性相似，区别较小。

图6 野生型蛋白与突变体Y93S在反应1 h（A）、2 h（B）条件下的pH稳定性Fig.6 pH stability of wild-type protein and mutant Y93S at the reaction time of 1 h(A)and 2 h(B)

3 讨论

本文采用计算机模拟与试验相结合的方法对葡聚糖酶进行定点突变，以期获得具有更高热稳定性的蛋白。本实验通过对葡聚糖酶分子结构分析，构造了突变体Y93S，优化后，其有96.86%的氨基酸残基的3D-ID的值≥0.2（蛋白质的氨基酸总数至少有80%≥0.2），葡聚糖酶主链二面角的99.4%Φ-Ψ角落在Ramachandran图的核心区和允许区，同时有研究表明葡聚糖酶的C-末端与其热稳定性无关，而其N-端和催化域与其耐热性有关[18]，因此优化后的分子结构可以用于分子动力学的研究。本试验结合均方根偏差、回旋半径和均方根涨落等参数分析，得出突变体Y93S蛋白的热稳定可能要高于野生型蛋白。其中，Y93S的RMSD值要低于野生型，这说明Y93S可能比野生型更加耐热；进一步分析Rg值，表明Y93S的Rg值较野生型蛋白的小，这说明其整体结构较为紧密，有利于适应高温环境。在363 K温度下，野生型的总溶剂可及表面比Y93S高出1.23 nm2，这可能是在高温环境下，野生型蛋白发生了去折叠，使得其总的溶剂可及表面增大造成的，随着温度的增加，野生型的总溶剂可及表面呈增加的趋势，而Y93S变化不明显，这可以说明Y93S的耐热性较好[19]。盐键数目有随着温度的增加而增加，这与THOMASAS等[20]研究的盐键在25～100℃范围内，随着温度的增加，其数目与作用力增加一致。野生型与Y93S蛋白分子间和蛋白质分子与水分子之间的数目随着温度的升高呈下降的趋势，其中Y93S较野生型在相同温度下，其与水分子间形成的氢键数目要高于野生型，这可能是与突变后的氨基酸残基的种类有关，Y93为疏水氨基酸，其带有苯环，具有一定的刚性使得酪氨酸分子的主链弯曲或羧基旋转更为困难，羧基与水分子间的距离较大，不利于与水分子形成氢键。丝氨酸为亲水氨基酸，其随着周围水分子的数目增加，其与水分子之间的氢键建长变短，键能增强，易于水分子形成氢键[21]。Y93S的静电相互作用，势能和总能量较野生型的低，这说明Y93S整体分子结构较野生型稳定，耐热性好。利用分子生物学试验构建Y93S突变体，通过对野生型与突变体的酶学性质分析发现，Y93S较野生型蛋白的最适温度提高了15℃，突变体的在90℃的半衰期较野生型从60 min提高到120 min以上，最适pH和pH稳定性与野生型相差无几，但在pH 8～10范围内，突变体较野生型的剩余酶活低。这可能与突变前后的氨基酸的种类有关，由于酪氨酸的R基较大，其解离常数偏碱性，而丝氨酸的R基解离常数偏中性，因此造成突变体Y93S在碱性环境下处理一定时间后，剩余酶活较野生型低。

4 结论

本研究通过计算机模拟筛选出突变体Y93S蛋白较野生型蛋白可能具有更高的耐热性，并用重叠PCR定点突变进行试验验证，试验结果为突变体Y93S的最适温度为70℃，较野生型提高了15℃，在90℃下的半衰期由60 min提高至120min以上，pH及pH稳定性变化不明显。通过理性设计对葡聚糖酶分子进行改造，减少了不必要的消耗，提高试验的效率，同时为其耐热机理提供有力依据。

[1]VIEILLE C,ZEIKUS G J.Hyperthermophilic enzymes:sources,uses, and molecular mechanisms for thermostability[J].Microbiol Mol Biol Rev,2001,65(1):1-43.

[2]CHAKRAVARTY S,VARADARAJAN R.Elucidation of determinants of protein stability through genome sequence analysis[J].Febs Lett, 2000,470(1):65-69.

[3]ARGOS P,ROSSMANN M G,GRAU U M,et al.Thermal stability and protein structure[J].Biochemistry,1979,18(25):5698-5703.

[4]LU B,WANG G,HUANG P.A comparison of amino acid composition of proteins from thermophiles and mesophiles[J].Acta Microbiologica Sinica,1998,38(1):20-25.

[5]ICHIKAWA J K,CLARKE S.A highly active protein repair enzyme from an extreme thermophile:the L-isoaspartyl methyltransferase from Thermotoga maritime[J].Arch Biochem Biophys,1998,358(2):222-231.

[6]STEWART R J,VARGHESE J N,GARRETT T,et al.Mutant barley (1→3,1→4)-β-glucan endohydrolases with enhanced thermostability [J].Protein Eng,2001,14(4):245-253.

[7]KIM S A,CHENG K J,LIU J H.A variant ofOrpinomyces joyonii 1,3-1,4-β-glucanases with increased thermal stability obtained by random mutagenesis and screening[J].Biosci Biotech Biochem,2002,66 (1):171-174.

[8]PONS J,QUEROL E,PLANAS A.Mutational analysis of the major loop ofBacillus1,3-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolases[J].J Biol Chem, 1997,272:13006-13012.

[9]詹冬玲，高楠，韩葳葳，等.分子对接和动力学模拟提高嗜热蛋白酶PhpI的活力[J].高等学校化学学报，2013（3）：628-633.

[10]BERENDSEN H J C,VAN DER SPOEL D,VAN DRUNEN R.GROMACS:a message-passing parallel molecular dynamics implementation [J].Comp Phys Commun,1995,91(1):43-56.

[11]ZIELKIEWICZ J.Structural properties of water:Comparison of the SPC,SPCE,TIP4P,and TIP5P models of water[J].J Chem Phys,2005, 123(10):104501.

[12]KAMINSKI G A,FRIESNER R A,TIRADO-RIVES J,et al.Evaluation and reparametrization of the OPLS-AA force field for proteins via comparison with accurate quantum chemical calculations on peptides[J].J Phys Chem B,2001,105(28):6474-6487.

[13]DARDEN T,YORK D,PEDERSEN L.Particle mesh Ewald:An N log (N)method for Ewald sums in large systems[J].J Chem Phys,1993, 98(12):10089-10092.

[14]WENNBERG C L,MURTOLA T,PALL S,et al.Direct-space corrections enable fast and accurate lorentz-berthelot combination rule lennard-jones lattice summation[J].J Chem Theo Comp,2015,11(12): 5737-5746.

[15]BERENDSEN H J C,POSTMA J P M,VAN GUNSTEREN W F,et al. Molecular dynamics with coupling to an external bath[J].J Chem Phys, 1984,81(8):3684-3690.

[16]XU T,ZHU T,LI S.β-1,3-1,4-glucanase gene fromBacillus velezensis ZJ20 exerts antifungal effect on plant pathogenic fungi[J].World J Microb Biot,2016,32(2):1-9.

[17]SHAM Y Y,MA B,TSAI C J,et al.Thermal unfolding molecular dynamics simulation ofEscherichia colidihydrofolate reductase:thermal stability of protein domains and unfolding pathway[J].Protein Struct Funct Bioinform,2002,46(3):308-320.

[18]李卫芬.热纤梭菌β-葡聚糖酶热稳定性机制的研究[D].杭州：浙江大学，2005.

[19]MYERS J K,NICK PACE C,MARTIN SCHOLTZ J.Denaturant m values and heat capacity changes:relation to changes in accessible surface areas of protein unfolding[J].Protein Sci,1995,4(10):2138-2148.

[20]THOMAS A S,ELCOCK A H.Molecular simulations suggest protein salt bridges are uniquely suited to life at high temperatures[J].J Am Chem Soc,2004,126(7):2208-2214.

[21]娄燕敏，吴文祥，刘国宇，等.量子化学方法研究丝氨酸与酪氨酸水合团簇几何构型[J].计算机与应用化学，2013（2）：111-115.

Effect of mutant enzyme Y93S on the thermal stability of glucanase from thermophilic Bacillus licheniformisSR01

WEI Yangdao1,2,3,YI Yi1,2,3*,LI Ya1,2,3,SHI Zhengyu1,2,3,WU Shihua1,2,3,LIANG Jianrong4
(1.College of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China; 3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes,Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545006,China;4.Liuzhou City Jiale Fish Feed Limited Company,Liuzhou 545002,China)

In order to improve the thermal stability of glucanse from thermophilicBacillus licheniformisSR01,the related amino acid residues were site-specific mutated.Through the analysis of its structure,the Y93S mutants were constructed.By using molecular dynamics simulation analysis,the Y93S mutants may have higher heat resistance ability.The Y93S expression vector was constructed by site directed mutagenesis technique and the effect of temperature on the activity of the expressed product was analyzed.Results showed that the optimum temperature of the mutant enzyme Y93S increased from 55℃to 70℃.At 90℃,the half-life period of the mutant enzyme Y93S increased from 60 min to 120 min;pH and pH stability did not change obviously than the wild type.The mutant enzyme Y93S greatly improved the thermal stability of the wild-type enzyme,it had potential application value in industry,and it provided a strong basis for the heat resistance mechanism of the glucanase.

molecular dynamics;thermophilicBacillus licheniformis;glucanase;thermal stability

Q93-33

0254-5071（2017）03-0109-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.023

2016-08-16

广西科学基金（2015GXNSFBA139068）；广西柳州市中小企业创新基金（2014F030618）

韦阳道（1989-），男，硕士研究生，研究方向为微生物分子生物学。

*通讯作者：易弋（1979-），男，教授，博士，研究方向为微生物学。