不同菌种发酵对豆豉游离脂肪酸构成的影响

谢艳华，陈力力，2，谢靓，李梦丹，李跑，陈淼芬，蒋立文，2*

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.食品科技和生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，湖南长沙410128）

不同菌种发酵对豆豉游离脂肪酸构成的影响

谢艳华1，陈力力1，2，谢靓1，李梦丹1，李跑1，陈淼芬3，蒋立文1，2*

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.食品科技和生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；3.兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心，湖南长沙410128）

熟化黄豆分别接种毛霉（总状毛霉）、细菌（纳豆芽孢杆菌）和曲霉（米曲霉），经不同发酵工艺形成三种不同类型的豆豉，研究三种不同菌种接种发酵处理对豆豉中游离脂肪酸构成的影响。结果表明熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉、曲霉型豆豉分别鉴定出9种、11种、9种、8种游离脂肪酸；四种样品中游离脂肪酸含量从高到低依次是毛霉型豆豉（3736.3mg/100g）＞熟化黄豆（1911.16mg/100g）＞细菌型豆豉（1 421.02 mg/100 g）＞曲霉型豆豉（924.55 mg/100 g），多不饱和脂肪酸含量分别为毛霉型豆豉（2 087.51 mg/100 g）＞熟化黄豆（1 065.53 mg/100 g）＞细菌型豆豉（731.17 mg/100 g）＞曲霉型豆豉（478.64 mg/100 g）。研究结果表明，经不同菌种发酵的豆豉游离脂肪酸组成和含量有差异。

豆豉；总状毛霉；纳豆芽孢杆菌；米曲霉；游离脂肪酸

本试验拟在黄豆发酵过程中，将总状毛霉（Mucor racemosus）、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）、米曲霉（Aspergillus oryzae）三者作为发酵剂分别接种其中，通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法进行分析、鉴定，通过与脂肪酸标准品对比，分析比较其中的游离脂肪酸组成和含量情况，探讨豆豉发酵加工过程中3种菌株对游离脂肪酸变化所起的作用，以期为合理有效地利用、开发及推广发酵豆制品提供可靠数据，为传统发酵大豆制品升级提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆：购于湖南农业大学东之源超市；总状毛霉（Mucor racemosus）CGMCC8700、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）：本教研室从纳豆中分离并纯化；米曲霉（Aspergillusoryzae）AS3.042：湖南农业大学食品科技学院提供。

甲醇溶液、正己烷（均为色谱纯）、无水硫酸钠、KOH、H2SO4、氯仿、异丙醇、乙酸、乙醚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；37种脂肪酸甲酯混标：美国西格玛奥德里奇公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AT气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；ML204/02精密天平：梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；KQ5200DE超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；DHG-9246A电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；XW-80A漩涡混合器：上海青浦沪西仪器厂；2323K冷冻离心机：德国HERMLE公司；FW100高速万能粉碎机：天津市太斯特仪器有限公司；SAX/PSA氨丙基固相萃取柱（6 mL，500 mg）：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酸标准曲线的制作

先将37种脂肪酸甲酯混标配制成标准储备液和标准工作液。

37种脂肪酸甲酯混标储备液：将质量浓度为10 g/L的37种脂肪酸甲酯混标1 mL移至10 mL容量瓶中，并用正己烷定容。-20℃条件下避光保存。

标准工作液：吸取2.5 mL37种脂肪酸甲酯混标储备液于5 mL容量瓶中，并用正己烷定容，制成0.500 0 g/L的标准工作液，再从中吸取2.5 mL于新的5 mL容量瓶中，正己烷定容，制成0.250 0 g/L的标准工作液，以此类推，逐级稀释，分别制成0.500 0 g/L、0.250 0 g/L、0.050 0 g/L、0.025 0 g/L、0.0100g/L、0.0050g/L的标准工作液以供GC-MS检测使用。

使用预先配制好的37种脂肪酸甲酯混标储备液和标准工作液1.000 0 g/L、0.500 0 g/L、0.250 0 g/L、0.125 00 g/L、0.100 0 g/L、0.050 0 g/L在给定GC-MS条件下进样，进样量l μL，每个浓度的工作液重复进样3次。以脂肪酸甲酯质量浓度（x）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 纯种毛霉型豆豉、细菌型豆豉、曲霉型豆豉的制作

纯种毛霉型豆豉的制作：黄豆精选去杂→浸泡→水洗→熟化（121℃、20 min）→冷却→接种扩大培养的毛霉菌→前发酵（25℃、48～72 h）→厌氧后发酵（8%食盐、0.5%蒸馏酒、1%生姜，发酵时间30 d以上）→成熟。

纯种细菌型豆豉的制作：黄豆精选去杂→浸泡约12 h使体积增加至2倍左右→熟化（121℃、20 min）→冷却→接种扩大培养的纳豆芽孢杆菌液→40℃发酵24h→冷藏48h。

纯种曲霉型豆豉的制作：黄豆精选去杂→浸泡（夏季4～6 h）→熟化（121℃、20 min）→摊凉→冷却→接种曲霉菌→制曲（30～35℃、48～72 h）→拌料（8%食盐、2%白酒和1%的甜酒）→装坛→厌氧保温后酵3个月以上。

1.3.3 熟化黄豆、毛霉型、细菌型和曲霉型豆豉粗脂肪提取[12]

称取熟化黄豆、毛霉型豆豉、成熟细菌型豆豉和曲霉型豆豉各60 g，置于80℃烘箱中干燥至恒质量，研磨粉碎后过40目筛得到干粉。将准确称取的0.12 g干黄豆粉和干豆豉粉置于15 mL试管中，加入正己烷6 mL。超声波功率350 W，温度40℃，提取时间为30 min。

1.3.4 熟化黄豆、毛霉型、细菌型和曲霉型豆豉游离脂肪酸

的分离[13]

称取熟化黄豆、成熟毛霉型豆豉、细菌型豆豉和曲霉型豆豉干粉0.36 g，用1 mL氯仿溶解，然后经氨丙基硅胶固相萃取柱吸附，用3 mL氯仿异丙醇（2∶1，V/V）洗脱中性脂肪，用3 mL的2%乙酸-乙醚溶液洗脱游离脂肪酸，将样品溶剂用氮气吹干。

1.3.5 熟化黄豆、毛霉型、细菌型和曲霉型豆豉游离脂肪酸

甲酯化

在已提取游离脂肪酸的15 mL试管中，加入0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液3 mL，60℃水浴酯化15 min，冷却至室温，加入体积分数5%硫酸-甲醇溶液3 mL，60℃水浴酯化15min，冷却后加入少许无水硫酸钠，4000r/min离心2min。静置分层，吸取上清液于干燥洁净试管中，使用漩涡混合器使其混合均匀，通过0.22μm的滤膜过滤后注入干燥好的洁净样品瓶中。

1.3.6 GC-MS分析条件

气相色谱条件：色谱柱：CD-WAX石英毛细管柱（30m× 0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：柱温45℃，保持1 min，以5℃/min速率升温至290℃，最后保持2 min。载气：高纯氦气（99.999%）；流速1.0 mL/min；进样口温度为250℃；不分流进样；进样量1 μL。

质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度200℃；发射电流150μA；倍增器电压1037V；萃取头接口温度220℃；电子能量70eV；质量扫描范围45～500m/z。

1.3.7 定性定量方法

样品均进行3次重复，将检测结果进行定性和定量分析，采用SAS、Origin7.5等软件进行数据分析，比较不同方法之间的差异性。

定性分析：将检测信息用美国国家标准技术研究所（nationalinstitute ofstandardsandtechnology，NIST）14s.LIB谱库检索，查询文献资料，对熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉和曲霉型豆豉中各脂肪酸甲酯进行核对和确认（相似度值≥90%，百分含量≥0.1%）。

定量分析：采用峰面积归一化法计算各种成分的相对含量，外标法计算各种成分的绝对含量。

2 结果与分析

2.1 目标物的标准曲线及其相关系数

按1.3.6中的色谱条件，经过GC-MS分析得到37种脂肪酸甲酯混标总离子流色谱图见图1。根据各相关色谱峰的离子质量，并检索NIST14s.LIB谱库，确定其脂肪酸的种类。预实验显示，4种样品中含有的脂肪酸大致有11种，其主要脂肪酸分别为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。由图1可知，脂肪酸甲酯总离子流图基线稳定且离子峰基本分离。

图1 脂肪酸甲酯混合标准品的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of fatty acid methyl ester mixed standards

根据不同质量浓度37种脂肪酸甲酯混合标准品的总离子流色谱图，以标准品质量浓度（x）为横坐标，相对应的标准品峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，结果见表1。

表1 主要脂肪酸甲酯线性关系实验结果Table 1 Linear regression equations,linear ranges and detection limits of main fatty acid methyl esters

由表1可知，各标准曲线回归方程相关系数R2均＞0.9990，说明在测定质量浓度范围内，几种脂肪酸甲酯线性关系良好，适合于4种大豆及豆豉相关脂肪酸的定量分析。

2.2 熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉及曲霉型豆豉游离脂肪酸的定量分析及不同发酵剂对豆豉游离脂肪酸种类、含量的影响

熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉及曲霉型豆豉中游离脂肪酸的GC-MS总离子流图见图2。

图2 熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉及曲霉型豆豉游离脂肪酸的GC-MS总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of free fatty acid in cooked soybean, Mucor-type Douchi,bacterial-type Douchi andAspergillustype Douchi by GC-MS

根据NIST 14s.LIB质谱数据库和人工谱图解析相结合的手段将色谱图经行比对，对总离子流图中各组分进行峰面积归一化，结合脂肪酸甲酯标准曲线得出的熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉以及曲霉型豆豉中游离脂肪酸种类及含量（以干基计）（表2）。熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉、曲霉型豆豉分别含有9种、11种、9种、8种游离脂肪酸，与毛霉型豆豉相比，原料黄豆和细菌型豆豉均未检测到肉豆蔻酸和（Z）-十六烯酸两种游离脂肪酸，而曲霉型豆豉除了未检测到上述两种游离脂肪酸，顺式-11-二十碳烯酸也未检测到。微生物具有分解脂质的作用，熟化黄豆接种毛霉后，黄豆中的油脂在毛霉和酯酶的作用下，分解得到各种游离脂肪酸，包括肉豆蔻酸和（Z）-十六烯酸。曲霉型豆豉与原料黄豆相比，不含有顺式-11-二十碳烯酸，是由于在氧气充足的条件下不饱和脂肪酸发生氧化作用[14]。

从脂肪酸的饱和程度分析，由表2可知，熟化黄豆、细菌型豆豉和曲霉型豆豉均含有5种饱和游离脂肪酸，毛霉型豆豉含有6种饱和游离脂肪酸；熟化黄豆和细菌型豆豉均含有2种单不饱和游离脂肪酸，而毛霉型豆豉含有3种单不饱和游离脂肪酸，曲霉型豆豉仅1种单不饱和游离脂肪酸；四种样品中均含有2种多不饱和游离脂肪酸。四者的游离脂肪酸饱和程度比例和种类基本类似。

表2 熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉、曲霉型豆豉中游离脂肪酸的鉴定结果Table 2 Identification results of free fatty acids in cooked soybean,Mucor-type Douchi,bacterial-type Douchi andAspergillus-type Douchi

熟化黄豆和豆豉中含有几种C13～C22的饱和游离脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸等。传统的观点认为饱和脂肪酸是一类“坏”的脂肪酸，早期研究[15]发现，富含饱和脂肪酸的膳食会使血清总胆固醇升高，尤其是低密度脂蛋白胆固醇的水平，增加患心血管疾病的风险。但最近有研究[16]表明饱和脂肪酸摄入不足也会对人体造成影响。另外，还有研究发现硬脂酸能作为ω-3多不饱和脂肪酸的补充来源[17]。因此，对于黄豆及豆豉的喜爱者不必有过多的担忧。

单不饱和脂肪酸（mono-unsaturatedfattyacids，MUFA）作为膳食脂肪酸中的一类，具有特殊的生理功能和独特的物理、化学特性，在日常饮食中也与人们接触密切。单不饱和脂肪酸最具代表性的是油酸，四种样品中油酸含量均较高，毛霉型豆豉中油酸含量高达652.24 mg/100 g。多年来，对单不饱和脂肪酸的生理与保健作用存在分歧，但近年来的研究普遍认为顺式单不饱和脂肪酸对胆固醇和血糖有明显降低的作用[18-20]，即油酸有降低胆固醇和血糖的作用，在四种样品中毛霉型豆豉的油酸含量最高，降胆固醇和血糖的效果可能更显著。

目前认为营养上最具价值的两类脂肪酸是n-6系列和n-3系列多不饱和脂肪酸（poly-unsaturated fatty acids，PUFA），主要包括亚油酸和亚麻酸。四种样品中含有较高的多不饱和脂肪酸，含量最低曲霉型豆豉也有478.64 mg/100 g，毛霉型豆豉中多不饱和脂肪酸含量高达2087.51mg/100g。亚油酸有助于生长、发育及妊娠，特别是皮肤和肾的完整性只依赖n-6系列多不饱和脂肪酸，其中亚油酸最为有效[21]。亚麻酸在体内代谢可生成二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），同时具备多不饱和脂肪酸的多种生理功能，突出表现在降血脂和对心血管疾病的防治上[22]。对于需要摄入较多多不饱和脂肪酸的人群，适当地多食用黄豆及其制品特别是毛霉型豆豉是比较适宜的。

毛霉型豆豉的饱和游离脂肪酸含量是熟化黄豆的1.90倍，不饱和游离脂肪酸是熟化黄豆的1.98倍，油酸、亚油酸、亚麻酸分别是熟化黄豆的2.02、1.94、2.05倍；熟化黄豆的饱和游离脂肪酸含量是细菌型豆豉的1.24倍，不饱和游离脂肪酸是细菌型豆豉的1.39倍；而熟化黄豆的饱和游离脂肪酸含量是曲霉型豆豉的1.70倍，不饱和游离脂肪酸是细菌型豆豉的2.25倍。毛霉型豆豉中游离脂肪酸远高于熟化黄豆中游离脂肪酸的原因有以下几个：一方面熟化黄豆在酯酶的作用下油脂水解产生大量游离脂肪酸，毛霉能够产生脂肪酶，将其中的脂肪分解成甘油和游离脂肪酸[23]，使豆豉产生芳香物质，同时改善豆豉风味和促进豆豉成熟[24]。另一方面毛霉型豆豉后发酵阶段是一个厌氧发酵阶段，且食盐、白酒等的添加使大部分微生物生长受到抑制，在氧气含量较低的情况下，脂肪酸自动氧化速率大大降低。而熟化黄豆接种纳豆芽孢杆菌和米曲霉后游离脂肪酸含量有所降低的原因可能是以下几个：第一，游离脂肪酸的自动氧化的速度高于油脂水解的速度；第二，在酶的作用下，饱和游离脂肪酸发生β-氧化作用而形成酮酸和甲基酮；第三，发酵过程中微生物的生长需要能量，消耗了大量的碳水化合物之后，需要消耗脂肪酸作为能量补充。分解脂肪酸的酶系可以分解豆豉中的游离脂肪酸，使之成为酯类等，从而赋予产品特有的香味。第四，在曲霉菌存在的条件下，饱和游离脂肪酸发生酶促氧化[25]。有研究发现丹贝（根霉型豆豉）中不饱和脂肪酸含量是原料黄豆的5.52倍，纳豆（细菌型豆豉）的7.15倍[11]。表明不同微生物和不同加工工艺对脂肪酸有影响，具体原因有待进一步探究。

3 结论

本研究采用正己烷提取熟化黄豆和豆豉中的脂肪酸，通过固相萃取柱分离出游离脂肪酸，经甲酯化处理，用气相色谱-质谱联用仪分析，熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉、曲霉型豆豉分别鉴定出9种、11种、9种、8种游离脂肪酸，其主要脂肪酸均为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸。通过与脂肪酸标准品进行对照，对样品中的游离脂肪酸进行定量分析，其中毛霉型豆豉中不饱和脂肪酸含量最高，达2 757.19 mg/100 g，分别是黄豆、细菌型豆豉、曲霉型豆豉的1.98、2.75、4.44倍。样品中还含有其他种类的含量较少的脂肪酸如：毛霉型豆豉中含有肉豆蔻酸7.60 mg/100 g等。研究表明，不同发酵工艺和发酵剂使豆豉中游离脂肪酸在组成及含量上均存在一定的差异。本研究可助力将不同发酵豆制品开发成不同功能性保健食品，同时为豆豉中脂肪酸指纹图谱的建立提供数据积累和研究依据。

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Effect of starter cultures on free fatty acid composition of Douchi

XIE Yanhua1,CHEN Lili1,2,XIE Jing1,LI Mengdan1,LI Pao1,CHEN Miaofen3,JIANG Liwen1,2*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China;3.National and Provincial Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative,College of Food Science and Technology,Changsha 410128,China)

Mucor racemosus,Bacillus nattoandAspergillus oryzaewere separately inoculated into cooked soybeans.Three different types of Douchi were prepared with different fermentation processes.The effect of these three strains on free fatty acids composition in Douchi was investigated.The results showed that there were 9,11,9,and 8 kinds of free fatty acids identified in cooked soybean,Mucor-type Douchi,bacterial-type Douchi and Aspergillus-type Douchi,respectively.The total free fatty acids contents in four samples in order wasMucor-type Douchi(3 736.3 mg/100 g),cooked soybean(1 911.16 mg/100 g),bacterial-type Douchi(1 421.02 mg/100 g),Aspergillus-type Douchi(924.55 mg/100 g).The polyunsaturated fatty acids contents in four samples in order wereMucor-type Douchi(2 087.51 mg/100 g),cooked soybean(1 065.53 mg/100 g),bacterial-type Douchi (731.17 mg/100 g)andAspergillus-type Douchi(478.64 mg/100 g).The results showed that the composition and contents of free fatty acids in different fermented Douchi were different.

Douchi;Mucor racemosus;Bacillus natto;Aspergillus oryzae;free fatty acids

TS214.2

0254-5071（2017）03-0080-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.017

2016-12-11

国家自然科学基金项目（31371828）

谢艳华（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：蒋立文（1968-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。

豆豉是一种传统调味副食品，古代称为“幽菽”，也叫“嗜”。豆豉以黑豆或黄豆为主要原料，利用毛霉、曲霉或者细菌蛋白酶的作用，分解大豆蛋白质，达到一定程度时，通过加盐、加酒、干燥等方法，抑制酶的活力，延缓发酵过程而制成[1]。研究发现，豆豉具有抗氧化[2-3]、降血压[4]、降血糖[5]等多种保健功能。

豆豉在发酵成熟过程中发生着复杂的化学变化，主要包括碳水化合物、蛋白质和脂肪的降解，使其口感更加细腻绵软[6]。豆豉风味是许多种化合物共同作用并在量上达到一定平衡才产生的，其中脂类物质在风味的形成中起很重要作用。脂肪组分中，游离脂肪酸不仅是营养成分，而且是风味形成的前体物质，可以改善口感质构，同时有保健功效。豆豉中游离脂肪酸主要包含硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等，这些脂肪酸能显著影响和改善人类神经或精神类疾病，作用于内分泌失调以及代谢综合症相关的疾病，如糖尿病[7-9]。游离脂肪酸中的不饱和脂肪酸在豆豉风味物质形成中起着非常重要的作用，其含量越多，最终形成的风味就越浓。发酵型产品微生物能够分泌脂肪酶，对产品中游离脂肪酸有一定的影响，有研究发现丹贝中的不饱和脂肪酸、必需脂肪酸中的亚油酸和亚麻酸的含量与大豆中脂肪酸相比均显著性增加[10]，并且接种不同微生物发酵剂对产品中游离脂肪酸的影响不同[11]。