结核性脑膜炎患者脑脊液利福霉素钠浓度监测

张晓东+姚芳

[摘要]目的 通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）建立结核性脑膜炎患者脑脊液中利福霉素钠的测定方法。方法 采用XTerraRMS C18色谱柱（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm），以醋酸铵（0.01 mol/L）-甲醇（10∶90）为流动相，流速为0.4 ml/min。经HPLC分离，以多反应监测（MRM）测定。结果 本方法在0.4～4.0 μg/ml浓度范围内线性良好（r=0.9997）；检出限为100 ng/ml。结论 本方法操作简单，结果准确，可用于结核患者脑脊液中利福霉素钠含量测定。

[关键词]高效液相色谱-质谱联用；结核性脑膜炎；脑脊液；利福霉素钠

[中图分类号] R969 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（b）-0012-03

[Abstract]Objective To establish a method for determination Rifamycin sodium in the cerebrospinal fluid of patients with tuberculous meningitis by HPLC-MS/MS.Methods Column was XTerraRMS C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）.Mobile phase was Ammonium acetate （0.01 mol/L）-Methanol（10：90）.Flow rate was 0.4 ml/min.Multiple reaction monitoring（MRM） was used by HPLC.Results The linear ranges of 0.4-4.0 μg/ml （r=0.9997） was better；Detection limit was 100 ng/ml.Conclusion The method is simple，rapid，accurate，and it can be used for therapeutic drug monitoring.

[Key words]HPLC-MS/MS；Tuberculous meningitis；Cerebrospinal fluid；Rifamycin sodium

结核病，又称痨病，是一种古老的传染病，它曾在世界范围广泛流行，并夺取数亿人的生命。自1944年发现链霉素对结核分枝杆菌有效及1962年利福霉素应用于临床以来，异烟肼等大量抗结核药物的出现，开创了以利福霉素、利福平、异烟肼为主的结核化疗时代，并使流行得到了一定的控制。结核性脑膜炎（tubercular meningitis，TBM）是由于结核分枝杆菌感染所致的中枢神经系统感染性疾病，是结核病中最严重的一种，若治疗不及时，可导致严重的神经系统并发症，最终引起患者死亡或遗留严重后遗症[1]。

治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）是应用现代分析技术测定患者体液中的药物及其代谢产物浓度，以优化设计或调整给药方案，以实现个体化治疗，提高疗效，减免毒副作用的药学技术方法[2]。TDM是近代临床药物治疗划时代的重大进展之一，也是结核化疗中的一个新的发展方向。血药浓度监测只是TDM的一个重要组成部分。本课题拟建立测定抗结核药物利福霉素在TBM患者脑脊液中浓度的方法并进行分析，制订合理的给药方案，以避免药物过量引起的不良反应及药物不足导致的治疗失败，也为今后其他项目（尿药浓度、痰药浓度、胸腹水药物浓度等）的TDM工作提供依据。

1仪器与材料

质谱仪：美国AB公司API3200LC-MS/MS质谱仪；液相色谱仪：日本岛津公司LC-20A型高效液相色谱仪，大气压化学电离源[3]；流动相为醋酸铵（0.01 mol/L）-甲醇（10∶90），醋酸铵、甲醇为色谱纯，利福霉素鈉为标准品。

2方法与结果

2.1分析条件

2.1.1液相色谱条件 色谱柱：沃特世公司C18柱，标准：4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm；流动相：0.01 mol/L的醋酸铵-甲醇（10∶90）；流速：0.4 ml/min；柱温：室温。

2.1.2质谱条件 减簇电压（DP）：95 V；碰撞室入口电压（CEP）：20 V；Q1入口电压（EP）：8.0 V；碰撞室出口电压（CXP）：20 V；离子源电压（IS）：5500 V；碰撞电压（CAD）：8.0 V；离子源：APCI，ESI；扫描方式：正离子扫描；温度（TEM）：500℃；气帘气（CUR）：20 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；MRM：719.9/688.2，CE：35 V；MRM：719.9/660.1，CE：40 V；MRM：719.9/295.0，CE：62 V[4-6]。

2.2溶液制备

2.2.1利福霉素钠标准储备液制备 称取利福霉素钠对照品0.010 03 g，置100 ml量瓶中，配制为100.3 μg/ml的溶液。

2.2.2利福霉素钠工作溶液制备 取利福霉素钠标准储备液， 置10 ml量瓶中，加甲醇-水（50∶50）溶液稀释至刻度，摇匀，得10.03 μg/ml的工作溶液。取10.03 μg/ml的利福霉素钠工作溶液1 ml置100 ml量瓶中，加甲醇-水（50∶50）溶液稀释至刻度，摇匀，得100.3 ng/ml的工作溶液。

2.3样品的来源和制备

2.3.1样品的来源 TBM患者脑脊液：2016年1～6月在内蒙古第四医院住院的TBM患者，住院期间行腰椎穿刺术取脑脊液。

2.3.2样品的制备 取患者脑脊液1 ml置15 ml塑料离心管中，精密加甲醇-水溶液（50∶50）4 ml，涡旋3 min，溶液经微孔滤膜（0.45 μm）过滤后，供液相色谱串联质谱仪测定[7]。

2.4 LC-MS/MS的条件

2.4.1 LC-MS/MS的条件选择 筛选不同的液相色谱柱及色谱、质谱条件[8-11]，最后确定为“2.1”项下的液相色谱串联质谱条件检测利福霉素钠，应用“2.1”项下的色谱-质谱条件进行分析。

2.4.2标准曲线 取2 μg/ml的标准溶液，分别进样1、2、4、5、6、8、10 μl，用“2.1”项下的LC-MS/MS条件进行测定，得到定量离子对719.9/688.2的峰面积。以测定浓度（X，μg/ml）为横坐标与峰面积（Y，counts）为纵坐标进行线性回归分析，线性方程为Y=5.22e+004X-1.52e+003（r=0.9997）。结果见表1、图1，提示利福霉素钠在0.4～4.0 μg/ml范围内线性关系良好。

2.4.3检测限 将100 ng/ml的利福霉素钠工作溶液进样5 μl，得信噪比S/N=3.6，该方法的检出限为100 ng/ml。

2.4.4精密度试验 将利福霉素钠制成0.4 g/ml的标准溶液6份，分别通过“2.1”项下的方法检测，得到的峰面积分别为19 754、18 965、20 038、18 997、19 765、18 661（RSD=2.9%），方法精密度较好。

2.4.5稳定性试验 将0.8 μg/ml的利福霉素钠标准溶液分别于0、1、4、8、12、24 h分别进样5 μl。采用上述液相色谱串联质谱条件进行分析，得到峰面积分别为38 970、41 120、40 665、38 385、38 100、36 919（RSD=4.1%），显示利福霉素钠在24 h内稳定。

2.4.6实际样品的测定试验 以时间（min）为横坐标，以响应浓度（cps）为纵坐标，分别做阴性对照色谱图及利福霉素钠对照品色谱图，分别见图2、3，应用本方法测定6例不同TBM患者脑脊液中利福霉素钠的量分别为0.51、0.43、0.40、0.68、0.35、0.28 μg/ml。

3讨论

利福霉素为半合成的广谱抗菌素，它对分枝杆菌，特别是对结核菌有强力的抑菌作用。利福霉素行静脉注射或局部应用效果较好，口服几乎不能达到有效的血药浓度；药代动力学方面，单次静脉滴注利福霉素钠0.5、1.0、2.0 g后的血药峰浓度（Cmax）分别为28、46、90 mg/L，1 h后即下降至50%左右。每6小时静注利福霉素钠0.5 g，稳态血药浓度为36 mg/L。血浆蛋白结合率<5%。血液消除半衰期（t1/2）为3～5 h[12]。该药在脑脊液中的分布情况及浓度少见详细报道，希望通过该项研究，弥补脑脊液中利福平、利福霉素药物浓度测定的不足，为进一步研究血液、脑脊液中药物代谢情况提供技术支持[13]。

同时，利福霉素的杀菌能力与药物在病灶区域的浓度有密切关系，但其具有肝脏毒性、胃肠功能紊乱、神经系统症状、血小板减少症和变态反应等严重的毒副作用[14]。因此，本课题通过监测生物体液中药物的浓度，以达到最佳治疗效果，并尽量减少毒副作用，具有重要的临床意义。

液质联用技术在分析药物及其在各种复杂生物基质（全血、血浆、尿、胆汁及生物组织）中的代谢产物时，由于其选择性强、灵敏度高，不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的样品前处理工作，而且能分离鉴定以往难于辨识的痕量药物代谢产物，尤其是串联质谱（MS/MS）的应用，通过多反应监测（MRM），可以大大提高分析的专一性，改善信噪比，提高灵敏度，从而快速、方便地解决问题[15]。

本研究采用液质联用的方法对TBM患者脑脊液中利福霉素进行检测，具有方法灵敏、准确、稳定性好等优点。脑脊液中药物浓度监测只是TDM中的一个重要组成部分。本课题通过建立结核药物监测的方法并进行药动学分析，以制订合理的给药方案，为今后其他药物治疗学监测工作提供依据。

[参考文献]

[1]梁莉，刘丽蓉，乐军，等.结核性脑膜炎患者脑脊液的蛋白质组学研究[J].中华医院感染学杂志，2010，20（24）：3863-3866.

[2]黄亮，张伶俐，李幼平，等.国内外治疗药物监测指南现状的循证研究[J].中国循证医学杂志，2016，16（4）：451-459.

[3]AB公司食品安全分析及应用技术专辑[Z].2013：23-70.

[4]国家药典委员会.中国药典[M].二部.北京：中国医药科技出版社，2015：496-500.

[5]药品生物制品鉴定所.中国药品检验标准操作规范与药品检验仪器操作规程（2005年版）[M/CD].北京：中国医药科技电子出版社，2005：231-235.

[6]韩峰，周亚丽.中成药中非法添加西地那非的质量标准研究[J].中国医药科学，2011，1（15）：51-52.

[7]杨晓萍，张晓惠，黄艳萍，等.RAM-HPLC在线富集技术检测脑脊液中利福平的浓度[J].南方医科大学学报，2015， 35（11）：1628-1632.

[8]张晓东，朱叶青，朱慧珍.LC-MS/MS法測定牛肉中玉米赤霉醇的残留[J].北方药学，2008，5（3）：13-15.

[9]郑国钢.雷米普利胶囊的质量、稳定性及生物等效性研究[D].杭州：浙江大学，2008.

[10]刘晓茜，姚亚敏，马芳，等.LC-MS/MS法测定大鼠血浆中的利福布丁[J].华西药学杂志，2012，27（2）：184-186.

[11]谢英新，王丰.HPLC-MS联用技术在药学中的应用[J].黑龙江医药，2007，5（19）：495-496.

[12]罗忠枚，夏小冬，崔玉彬，等.利福霉素类抗生素及其构效关系研究进展[J].中国抗生素杂志，2012，37（4）：308-311.

[13]杨玉.利福霉素和利福平[J].江苏医药，1975，2（127）：46-52.

[14]王延涛，李爽，夏玉朝，等.利福霉素的研究新进展[J].当代医学，2016，22（6）：16-22.

[15]刘祥东，梁琼麟，罗国安，等.液质联用技术在医药领域中的应用[J].药物分析杂志，2005，25（1）：110-116.

（收稿日期：2016-12-23 本文编辑：方菊花）

[基金项目]内蒙古自治区医疗卫生计生科研计划项目（2013 03027）