基于磁性纳米载体的固定化脂肪酶在生物柴油中的应用研究进展

张玮玮，杨慧霞

（宁夏大学化学化工学院，宁夏银川 750021）

专论与综述

基于磁性纳米载体的固定化脂肪酶在生物柴油中的应用研究进展

张玮玮，杨慧霞

（宁夏大学化学化工学院，宁夏银川 750021）

由于化石燃料的全球性短缺和日益严重的环境问题，固定化脂肪酶在制备生物柴油中的应用研究已经成为一个热点。磁性纳米载体不仅具有纳米尺寸的特性，而且易于从反应体系中分离，在固定化酶领域引起了广泛关注。本文综述了国内外基于磁性纳米载体的固定化脂肪酶在生物柴油转化中的应用研究进展，并结合绿色高效生物催化过程的发展要求对新型磁性固定化脂肪酶的研究方向及发展前景提出了展望。

脂肪酶；固定化；磁性纳米载体；生物柴油

近年来，由于化石燃料的全球性短缺，以及由化石燃料产生的大量温室气体带来的日益加剧的环境压力（温室效应、臭氧空洞、雾霾天气等），使得全球都面临着严峻的能源危机和环境挑战。生物柴油是由一系列脂肪酸烷基酯（FAAEs）组成的混合物，可以由植物油，动物脂肪或餐厅食用废弃油与醇类的酯交换反应而得到，相对安全，无毒，可生物降解。作为一种可再生的替代能源，与化石燃料相比产生较少的空气污染物，是目前一种重要的新型替代燃料，已经获得越来越多的关注[1，2]。目前全球的生物柴油供应几乎全部来源于碱或酸催化的化学催化过程。虽然化学催化的酯交换过程具有反应时间短和产率高的优点，但是同时也存在若干不可避免的缺点，例如较高的能量需求，催化剂和甘油的回收困难，以及对环境的潜在污染等[3]。因此，高效绿色的制备生物柴油燃料替代化石燃料的方法正吸引全球越来越多的关注。而脂肪酶催化的酯交换过程由于其良好的转化率，温和的反应条件和相对简单的产物及副产物的提纯步骤等突出优势，在生物柴油生产中有重要的应用潜力[1，4]。

然而，从经济角度来说，酶催化过程在工业规模上的应用仍然存在较大的挑战，包括催化效率，操作稳定性，可回收性等。同时，酶的高成本，也将不可避免地增加工业生产的成本和能量消耗。酶的固定化技术可以有效地提高酶的催化性能和操作稳定性，并降低其制造成本，而成为一种广泛使用的技术[5，6]。脂肪酶的固定化技术可以提高生物柴油的生产量和效率。大大提高了生物柴油在未来的经济可行性。与游离的脂肪酶相比，固定化脂肪酶在生物柴油转化反应中有许多优势，例如固定化酶便于从反应体系中分离，可以回收进行连续操作，以及简单的产品纯化过程等。尽管经过固相载体固定化的酶可以通过简单过滤从反应体系中分离，但与游离的酶相比，反应底物和产物在酶分子内部的扩散，仍然存在传质阻力的影响而导致催化效率较低。纳米材料作为固定化酶载体的应用则可以避免传质阻力的影响。然而，基于纳米材料固定化酶由于载体尺寸太小难以从反应体系中分离。随着磁性纳米载体的不断研究可以很好地解决上述两方面问题。由于磁性纳米载体比表面积大、饱和磁矩高、表面易功能化修饰、具有良好的磁导向性、生物相容性、生物降解性，可以结合多种生物功能分子，且通过外加磁场很容易从反应体系中分离出来，因此被广泛应用于不同方法制备的固定化脂肪酶领域[7-9]。

目前常见的固定化方法可以分为以下四大类方法：物理吸附法、包埋法、共价偶联法和交联法。而根据其作用方式的不同，又可以分为物理法和化学法。本文对近几年在固定化脂肪酶催化的生物柴油研究进行了一个系统的分类，并阐述了磁性载体的结构及固定化方法的选择对脂肪酶在催化生物柴油反应中的活性差异的影响。

1 物理法

磁性纳米粒子之间存在的磁引力使其易于聚集而影响载体的分散性能，且在空气中容易发生氧化，因此常常使用其他试剂对磁性离子表面进行修饰，形成核壳结构。一方面减少磁性纳米粒子的氧化和聚集，一方面提高酶的负载率，是当前广泛使用的保护方法。

物理吸附是通过氢键、疏水性相互作用和π-电子亲和力等物理作用力将酶分子固定在不溶性载体上的一种固定化方法，是最简单的酶固定方法。对于脂肪酶来说，疏水作用通常是最常见的作用方式。由于脂肪酶比起其他种类的蛋白质，可以更高效自发地从水溶液吸附到疏水表面，因此该方法可以同时实现脂肪酶的纯化和固定化[10，11]。有趣的是，吸附在载体上往往会提高脂肪酶的催化活性[11]。这可能是由于载体与脂肪酶分子间的疏水作用，类似于界面活化现象，促进了酶分子结构中“盖子”的打开。

Tran等[12]将从伯克霍尔德菌脂酶（lipase from Burkholderia sp.C20）吸附固定在用二甲基十八烷基［3-（三甲氧基硅基）丙基］氯化铵修饰的磁性纳米粒子上催化生物柴油的合成。长链疏水性基团的表面修饰促进了酶分子的吸附固定化，在橄榄油的甲酯化反应中，反应30 h可以得到90%的转化率，且可以有效回收10次。

Liu等[13]将lipase from Burkholderia sp.（BCL）吸附固定化在疏水性表面修饰的磁性载体上，在酯交换反应中回收6次，活性没有明显降低。同时采用响应曲面法优化了固定化酶催化的酯交换反应条件制备生物柴油，在最优的反应条件下，固定化BCL表现出和市售的脂肪酶Novozyme 435相当的酯交换效率。

物理固定化方法相对操作简单，反应条件相对温和，不影响酶分子的高级结构和活性中心，利于酶的活性保留，但是缺点在于，物理法固定的酶与载体相互作用力弱，酶易从载体上脱落下来。因此，基于磁性载体的物理固定化酶在生物柴油应用中的相关报道并不多。

2 化学法

化学固定法的反应条件较为剧烈，容易引起酶蛋白的空间结构发生变化，破坏酶的活性中心，甚至酶的底物专一性等性质也会发生变化，尤其是当共价结合涉及到酶的活性中心的氨基酸时，酶的失活较为严重。此外，共价结合法是一种不可逆的固定化方法，载体不能回收，操作过程相对复杂，以致固定化成本较高[14]。但优点是酶与载体的结合较为牢固，酶分子不易脱落，有良好的稳定性和重复使用性，更利于酶的多次回收使用和工业化应用的拓展。

Wang 等[15]将 lipase of Pseudomonas cepacia（PCL）共价交联在氨基修饰的磁性纳米颗粒上，并应用于大豆油和甲醇的酯交换反应。实验结果证明，经过共价固定化以后PCL对甲醇的耐受性显著提高，反应 24 h得到95%的转化率，且回收3次以后转化率没有明显的下降。同时，实验发现将该固定化PCL应用于叶轮搅拌的反应器中，活性显著提高，推测应该是充分的搅拌促进了反应物的混合和扩散。

Xie和Wang[16]制备了一种磁性的聚（苯乙烯-co-甲基丙烯酸）微球复合材料，通过1-乙基-3-（3-（二甲基氨基）丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDAC）共价法固定皱褶假丝酵母脂肪酶（CRL）。与游离的CRL相比，经过共价固定以后的酶热稳定性和pH稳定性均有明显提高，且在大豆油的酯交换生物柴油反应中表现出较高的活性。在35℃下反应24 h达到86%的转化率，回收使用4次活性没有明显的降低。

余孝其课题组[17]报道了一例表面活性剂活化结合磁性脂肪酶交联酶聚集体（CLEAs）的固定化脂肪酶模型，并将其应用在连续生产生物柴油中。采用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的磁性纳米粒子为载体，与表面活性剂活化的TLL交联酶聚集体交联。在酶分子沉淀之前加入修饰的磁性纳米粒子，既可以作为酶分子沉淀的内核，同时与酶分子发生交联。不但可以避免二次粒子的生成，降低固定化酶结构内部的传质阻力，而且可以有效提高交联酶聚集体的固定化效率和稳定性。在最佳的实验条件下，生物柴油反应得到88%的产率，且回收10次活性几乎没有降低。

介孔二氧化硅作为目前发展最成熟、研究最透彻的介孔材料具有独特的孔道结构，可以提高载体的比表面积和固定化酶的活性及稳定性，也可以对磁性纳米粒子进行修饰，形成复合材料来制备酶固定化载体[18]。Xie等[19]通过化学共沉淀法制备得到磁性纳米粒子，再通过stober法在其表面包裹介孔材料MCM-41，从而得到负载MCM-41的Fe3O4核壳结构。经过氨基修饰以后的复合载体，可以通过戊二醛交联，共价固定褶皱假丝酵母脂肪酶（CRL）。固定化的CRL在大豆油和动物油脂的生物柴油反应中表现出优良的催化活性和选择性，在5次的回收实验中活性基本保持不变。同时MCM-41的负载不但有效降低了Fe3O4粒子之间的强磁偶极-偶极相互作用，还不影响Fe3O4粒子的饱和磁矩，使得固定化酶可以通过外加磁场从反应体系中快速分离。

固定化酶技术展示出优异的稳定性和较高的活性保留，大大提高了反应过程的经济效益。但固定化过程也可能会导致不同程度的酶的失活，且固定化过程的复杂程度不同。固定化方法的差异会得到不同的固定化效果，而且同一种方法也不会适用于所有的酶。因此，固定化方法的选择尤为重要。

随着磁性纳米载体研究的不断深入，磁性复合材料在固定化酶领域已有广泛的应用。利用磁性纳米材料良好的生物相容性、大比表面积、且易于表面修饰，易磁性分离便于回收使用的优势，使得磁性的固定化脂肪酶在生物柴油的工业化应用中存在巨大潜力，也已经取得一定的进展。尽管如此，磁性固定化脂肪酶在生物柴油的工业应用中仍存在一些需要进一步研究、解决的问题：（1）通常磁性纳米粒子需要进行表面修饰，使得磁性载体的制备相对复杂，限制了磁性固定化酶在工业上的应用；（2）现阶段关于磁性固定化脂肪酶在填充床反应器中的应用研究较少。发展制备简单、高酶活保留、适用性广、易于大规模制备的磁性固定化脂肪酶将对促进可持续和具有成本效益的生物柴油生产的发展具有重要意义，仍需要进一步深入研究。

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Research advances in magnetic nanocarriers immobilized lipase for biodiesel production

ZHANG Weiwei，YANG Huixia
（College of Chemistry&Chemical Engineering，Ningxia University，Yinchuan Ningxia 750021，China）

Due to limited energy reserves and the increasing environmental pressure,the application of immobilized lipase is becoming the hot topic in the field of biodiesel production.Among all types of nanoparticles,magnetic iron oxide nanoparticles have attracted a great deal of attention because of their high specific surface area,which can efficiently improve enzyme loading and be easily recycled using a magnetic field.This review covers recent advances in the recent developments of potential lipase immobilization based on magnetic nanoparticles and their application in biodiesel production.The outlook of lipase immobiliza－tion is also prospected.

lipase；immobilization；magnetic nanoparticles；biodiesel

TE667

A

1673-5285（2017）12-0001-04

10.3969/j.issn.1673-5285.2017.12.001

2017－11-22

宁夏自然科学基金项目，项目编号：NZ1645；宁夏高等学校科研项目，项目编号：NGY2017045；宁夏青年科技人才托举工程项目资助；宁夏大学引进人才项目，项目编号：BQD2015012。

张玮玮，女（1987－），讲师，博士研究生，主要研究方向为生物催化及生物质转化，邮箱：zhangww@nxu.edu.cn。