一例猪肺炎链球菌病的诊断与防治

2017-04-06刘维康

猪业科学 2017年3期

关键词：肺炎球菌链球菌病链球菌

刘杰，刘维康

(河南省洛阳市普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳 471000）

一例猪肺炎链球菌病的诊断与防治

刘杰，刘维康

(河南省洛阳市普莱柯生物工程股份有限公司，河南洛阳 471000）

肺炎链球菌又称肺炎球菌为链球菌属一员，主要寄生在人和动物的呼吸道中，猪肺炎链球菌病的主要症状为幼畜出现败血症和大叶性肺炎及脑膜炎等；在临床诊断中发现疑似病例，并在实验室诊断中分离到一株疑似菌株，经形态学、生化及分子鉴定确定为肺炎链球菌；药敏试验结果为病原菌对头孢噻呋、左氧氟沙星、杆菌肽、阿米卡星高度敏感，对甲氧苄啶、卡那霉素、甲砜霉素、盐酸克林霉素、盐酸林可霉素、庆大霉素不敏感。

猪肺炎链球菌；生化鉴定；PCR鉴定；药敏试验

2016年11月河南某猪场刚断奶仔猪发生以咳嗽、呼吸困难、发热为主要特征的传染病。通过对病猪进行解剖发现病死猪气管内充满泡沫状分泌物，肺呈大叶性肺炎变化，有不同程度病变，经实验室诊断确定为猪肺炎链球菌。

1 材料与方法

1.1 组织

无菌采集发病仔猪的肺脏。

1.2 主要培养基及试剂

哥伦比亚血琼脂基础培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基和MH培养基，由青岛海博试剂有限公司提供；革兰氏染色试剂购自北京索莱宝科技有限公司；DNA Taq酶、dNTPs、DNAmarker等购自宝生物（大连）工程有限公司；细菌微量生化管及药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

图1 肺炎球菌菌落形态

表1 生化鉴定结果

图2 分子鉴定结果

表2 药敏试验结果

1.3 方法

1.3.1 培养基制备

按照配方称取足量哥伦比亚血琼脂基础培养基，加相应的纯化水配制100 mL培养基，121 ℃，灭菌15 min，灭菌结束后待培养基温度降至50 ℃左右，加入5 mL的绵羊血，摇匀，制成血平皿。

1.3.2 细菌分离

无菌取肺脏病变组织触片染色镜检，并接种于血培养基上， 37 ℃，培养24 h，观察菌落形态，挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检。

1.3.3 生化鉴定

挑取疑似单个菌落接种于微量生化管，进行相应的生化鉴定。

1.3.4 分子鉴定

针对链球菌延伸因子EF-Tu基因，杜海燕等[1]设计了一对引物，序列为：P1：5’-GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC-3’/ P2：5’-ACGTTCGATTTCATCACGTT-3’扩增的目的片段大小为197 bp，有宝生物工程（大连）有限公司合成。

采用25μL反应体系，即10×PCR Buffer2.5μL、dNTP 2.0μL、DNA Taq酶0.5μL，P1/P2引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O 16.0μL。PCR反应条件为：95 ℃5 min，95 ℃1 min，59 ℃1 min，72 ℃1 min，共30个循环；72 ℃5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.5 药敏试验

挑取疑似单个菌落接种于10 mLTSB血清培养基，置于37 ℃恒温摇床中，培养5～6 h，取100μL均匀涂布于MH培养基上。用纸片琼脂扩散法（K-B法）[2]，按使用说明书将药敏片均匀放置在其上，37 ℃培养16～18 h后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小，根据说明书敏感和耐药性的最小抑菌圈直径判定菌株的药敏性。