丹参酮ⅡA对心肌缺血再灌注损伤大鼠氧化应激的保护作用

汤世民++吴咏梅++周雨亭++李欣悦++孟祥宝

[摘要] 目的 觀察丹参酮ⅡA对大鼠心肌缺血再灌注损伤诱导的氧化应激反应的作用。 方法 采用随机数表法将40只雄性SD大鼠随机分为四组，每组10只，分别为假手术组、模型组、丹参酮ⅡA 30 mg/kg组、辛伐他汀50 mg/kg组。预给药7天，丹参酮ⅡA腹腔注射给药，辛伐他汀灌胃给药，假手术组和MIRI模型组大鼠则灌胃和腹腔注射等量体积的生理盐水。末次给药1h后，采用冠状动脉左前降支结扎制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。硫代巴比妥酸（TBA）法检测血浆和心肌组织的丙二醛（MDA），羟胺法检测超氧化物歧化酶（SOD），可见光法检测过氧化氢酶（CAT），比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）；Western bolt法检测心肌组织Nrf-2、HO-1蛋白的表达水平。 结果 丹参酮ⅡA 30 mg/kg和辛伐他汀50 mg/kg均能显著增加MIRI大鼠血清和心肌组织中SOD、CAT和GSH-Px活力（P < 0.01），降低MDA水平（P < 0.01），增加心肌组织Nrf-2和HO-1蛋白的表达水平（P < 0.05）。 结论 丹参酮ⅡA对大鼠心肌缺血再灌注损伤诱导的氧化应激反应有显著的抑制作用。

[关键词] 丹参酮ⅡA；心肌缺血再灌注损伤；氧化应激

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（a）-0008-04

The protective effect of TanshinoneⅡA on oxidative stress induced bymyocardial ischemia reperfusion injury of rats

TANG Shimin1 WU Yongmei1 ZHOU Yuting2 LI Xinyue1 MENG Xiangbao3 ZHANG Hui1▲

1.College of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，China；3.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of TanshinoneⅡA on oxidative stress induced by myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI） of rats. Methods 40 SD rats were randomly divided into sham group， myocardial ischemia reperfusion injury （MIRI） group，TanshinoneⅡA 30 mg/kg group andsimvastatin 50 mg/kg groupby random number method.All the rats werepretreated for 7 days.TanshinoneⅡA was given by abdominal injection，and simvastatin was given by gastric perfusion，while the sham and model groups were given equal volume of saline solution by abdominal injection and gastric perfusion.After 1h of the last administration，the model of MIRI was establised by ligatingthe left anterior descending branch of coronary artery.Malondialdehyde（MDA）in serum and myocardial tissue was detected by thiobarbituric acid（TBA）method，Superoxide Dismutase（SOD）was detected by hydroxylamine method，Catalase （CAT） was detected by Visible light， Glutathione peroxidase（GSH-Px） by colorimetric method. The expression of Nrf-2 and HO-1 protein were measured by Western blot. Results TanshinoneⅡA and simvastatin couldincrease the activity of SOD，CAT，GSH-Px（P < 0.01），reduce the MDAin serum and myocardial tissue（P < 0.01），and increase the expression level of Nrf-2 and HO-1 proteinin myocardial tissueof MIRI rats（P < 0.01）. Conclusion TanshinoneⅡAhas significant inhibitory effect onoxidative stress induced by MIRI of rats.

[Key words] TanshinoneⅡA；Myocardialischemia reperfusion injury；Oxidative stress

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指缺血的心肌在恢复供血后，不仅功能未得到恢复，反而损伤加重，出现心律失常、梗死面积扩大、舒缩功能降低等现象[1]。MIRI发生机制复杂，其中由于再灌注引起的氧自由基大量积累所导致的氧化应激损伤是重要的机制之一[2]。MIRI是临床缺血性心脏病治疗过程中的难题[3]，目前仍没有较好的防治方法。

中药防治冠心病有独特的疗效[4-5]。丹参（Salvia？鄄miltorrhiza Bge.）为唇形科多年生草本植物，以根入药，具有活血化淤、通经止痛、清心除烦等功效[6]，临床广泛用于心脑血管疾病的治疗。丹参酮（tanshinone）为丹参的有效活性组分，其中丹参酮ⅡA为丹参酮中含量最高的活性成分[7]，在心血管疾病以及抗炎、抗肿瘤等方面有较好效果[8-11]。本研究采用大鼠冠状动脉左前降支结扎[12]所造成的急性心肌梗死模型，以丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），和Nrf-2、HO-1蛋白表达水平为考察指标[13-14]，探讨丹参酮ⅡA对MIRI氧化应激的作用，以期为冠心病的临床治疗提供实验参考。

1 材料与方法

1.1试验动物

健康雄性SD大鼠，体重260～280 g（2月龄），无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物质量合格证号为SCXK（京）2012-0001。动物到达之后，在SPF级动物房适应性饲养1周，饲养条件为室温18～25℃，环境相对湿度为50%～80%，自由饮食饮水，每组均给予正常饲料喂养。

1.2 药物及试剂

丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（上海第一生化药业有限公司，20160403）。辛伐他汀片（美国默沙东公司，M013303）。戊巴比妥钠（Sigma公司，P3761）。羧甲基纤维素钠（Amresco公司，BS0308）。MDA（批号：20160826）、SOD（批号：20160723）、CAT（批号：20160902）和GSH-Px（批号：20160622）试剂盒购于南京建成生物工程研究所。Tissue Protein Extraction Kit（批号：01434/40116）、BCA Protein Assay Kit（批号：30134）、SDS-PAGE Gel Kit（批号：20118）和eECL Western Blot Kit（批号：00081508）均购自北京康为世纪生物科技有限公司。Nrf2、HO-1、β-actin抗体均购自Santa Cruz公司；HRP标记的二抗购自中杉生物有限公司。

1.3 仪器

电子天平（AL104-IC型，Mettler Toledo公司）。多导（16道）生理记录仪（MP150型，BIOPAC公司）。小动物呼吸机（ALS-V8S型，上海奥尔科特生物科技有限公司）。酶标仪（Tecan Infinite M1000 PRO型，Tecan公司）。离心机（L550型，湘仪离心机仪器有限公司）。Bio-rad ChemiDoc XRS+ System，（Bio-Rad公司）。

1.4 动物分组及给药

采用随机数表法将40只雄性SD大鼠随机分为四组，每组10只，分别为假手术组、模型组、丹参酮ⅡA 30 mg/kg组、辛伐他汀50 mg/kg组。MIRI前连续给药7d，丹参酮ⅡA腹腔注射给药，辛伐他汀灌胃给药，假手术组和MIRI模型组大鼠则灌胃和腹腔注射等量体积的生理盐水。

1.5 大鼠心肌缺血再灌注模型制备

3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，经口气管插管，连接呼吸机，仰卧固定，记录心电。左胸部脱毛，消毒，于3～4肋间切皮钝性分离开胸。在肺动脉圆锥左侧与左心耳交界下缘2～3 mm处，以6-0无创缝合针丝线，进针深度1.5～2.0 mm，宽2～3 mm，丝线经套管套入，收紧丝线以止血钳固定套管，进行心肌缺血，肉眼观查心脏左室壁出现变暗变紫，且心电图呈示ST段明显抬高（> 0.25 mV）为结扎成功。缺血30 min后，松开止血钳，取下套管恢复心肌供血再灌注。取出结扎线，关闭胸腔，缝合伤口，充分排空左侧胸腔内气体，待大鼠麻醉清醒后撤出呼吸插管，恢复自主呼吸[15]。假手术组只穿线不结扎，其他操作与模型组相同。再灌注8 h后取材，收集相关数据。

1.6 血浆中氧化应激指标（MDA、SOD、CAT和GSH-Px）检测

腹主动脉取血5 mL，肝素抗凝，3000 r/min（r=156.25 mm）离心10 min取血清。南京建成试剂盒检测血清MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平。

1.7 心肌组织中氧化应激指标检测

取大鼠心脏梗死区域心肌组织，匀浆，3000 r/min（r=156.25 mm）离心10min取上清。南京建成试剂盒检测MDA、SOD、CAT和GSH-Px水平。

1.8 Western blot 检测心肌组织Nrf2、HO-1表达

取梗死区心肌组织，按说明书分别进行全细胞、胞核和胞浆蛋白的提取，BCA法测定蛋白含量，取蛋白样品与5×还原loading buffer混合后沸水煮沸5 min，使蛋白变性。SDS-PAGE电泳分离，湿转法将蛋白转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭，再分别与兔抗大鼠β-actin抗体（1∶1000）、Nrf2抗体（1∶500）、HO-1抗体（1∶500）4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，然后與HRP标记的二抗羊抗兔（1∶1000）室温孵育，以高灵敏度化学发光检测试剂盒 eECL Western Blot Kit显影，通过Bio-rad ChemiDocXRS化学发光成像系统进行曝光分析。

1.9 统计学处理

运用SPSS19.0统计软件进行统计分析，实验数据以（x±s）表示，采用非配对的t检验和One-way ANOVA对计量数据进行统计分析，P < 0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆氧化应激指标检测结果

与假手术组比较，模型组血清中的MDA水平显著升高（P < 0.01），SOD、CAT和GSH-Px活力显著下降（P < 0.01）。与模型组相比，丹参酮ⅡA（30 mg/kg）组和辛伐他汀（50 mg/kg）组均能够降低血清中的MDA水平（P < 0.01），增加SOD、CAT和GSH-Px活力（P < 0.01）。见表1。

2.2 心肌组织氧化应激指标检测结果

与假手术组比较，模型组心肌组织中的MDA水平显著升高（P < 0.01），SOD、CAT和GSH-Px活力显著下降（P < 0.01）。与模型组相比，丹参酮ⅡA 30 mg/kg组和辛伐他汀50 mg/kg组均能够降低心肌组织中的MDA水平（P < 0.01），增加SOD、CAT和GSH-Px活力（P < 0.01）。见表2。

2.3 各组心肌组织Nrf-2、HO-1蛋白表达检测结果

如图1所示，与假手术组比较，模型组胞浆和胞核Nrf2蛋白表达显著升高（P < 0.01），Nrf2核转位率显著增加（P < 0.01）。与模型组比较，丹参酮ⅡA 30 mg/kg和辛伐他汀50 mg/kg组胞浆Nrf2蛋白表达量显著降低（P < 0.01），胞核Nrf2蛋白表达量显著升高（P < 0.01），Nrf2核转位率显著增加（P < 0.01）。与假手术组比较，MIRI模型组心肌组织中的HO-1蛋白表达水平显著升高（P < 0.01）。与模型组相比，丹参酮ⅡA 30 mg/kg和辛伐他汀50 mg/kg組的HO-1蛋白表达水平显著升高（P < 0.01）。

3 讨论

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内氧自由基产生过多，清除能力降低，导致氧化系统和抗氧化系统失衡，从而引起的氧化损伤过程[16]。Nrf2是调节抗氧化应激反应的重要转录因子[17]。在氧化应激条件下，Nrf2发生核转位进入细胞核[18]，与抗氧化反应元件（antioxidant response elements，ARE）[19]结合，启动ARE调控的第Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表达，增强细胞对氧化应激和亲核化合物的抗性。ARE调控的抗氧化基因HO-1[20]等表达增加，保护机体免受活性氧的侵害。

本研究结果显示，与模型组相比，丹参酮ⅡA 30 mg/kg组和辛伐他汀50 mg/kg组血清和心肌组织中的MDA水平显著下降（P < 0.01），SOD、CAT和GSH-Px活力显著增加（P < 0.01）；心肌组织胞核 Nrf2 蛋白表达量显著升高（P < 0.01），Nrf2核转位率显著增加（P < 0.01）；HO-1蛋白表达水平显著升高（P < 0.01）。表明丹参酮ⅡA 30 mg/kg和辛伐他汀50 mg/kg均能显著抑制MIRI诱导的大鼠氧化应激反应，提高机体抗氧化能力。

综上所述，丹参酮ⅡA 30 mg/kg可抑制MIRI诱导的大鼠氧化应激反应，其机制可能与增强内源性抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力，抑制脂质过氧化，激发Nrf2调控的抗氧化反应，增加抗氧化蛋白HO-1的表达水平有关。

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（收稿日期：2016-10-27 本文编辑：杜雪）