核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料在生物检测中的应用

刘 梦， 何 月， 刘昕雯， 袁 荃

(教育部生物医学分析化学重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

1 前言

稀土上转换纳米材料是一种能够吸收长波长光并发射出短波长光的发光材料，它能连续吸收两个或多个低能量的光子，并通过系列非线性光学过程将其转换成一个高能量光子辐射出来[1 - 2]。稀土上转换纳米材料具有光学稳定性好、发射波长可调控、生物相容性好等优点[3 - 5]，更重要的是其可以被近红外光激发，能有效地抑制背景荧光的干扰，在生物分析检测中得到广泛应用[6 - 8]。然而，单纯的上转换纳米材料用作检测时对目标物没有选择性，因此将其与具有特异性识别功能的分子结合是实现对目标物高选择性检测的关键[9 - 10]。

核酸适配体是具有选择性识别功能的单链DNA或RNA序列[11 - 12]，它能够与小分子、蛋白质、核酸和细胞等靶标物进行高效、高特异性结合，被称为“化学抗体”[13 - 15]。与抗体相比，核酸适配体具有设计灵活、易于化学合成和修饰、成本低廉、生物化学稳定性高等优点，在生物分析检测等领域有着广泛的应用[16 - 19]。将核酸适配体与稀土上转换纳米材料相结合，能够发展一系列灵敏、高选择性、高效、简便的分析检测平台[20 - 22]。本文主要综述了近几年核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料在小分子、蛋白质、核酸、病原微生物、细胞等生物分子检测中的应用，并展望了其在分析检测领域的发展前景。

2 核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料在生物检测中的应用

2.1 小分子检测

2.1.1ATPATP是各项生命活动所需能量的提供者，是生物体内能量代谢和转换的重要枢纽[23]，与细胞中的各种生命活动息息相关。ATP的检测在疾病预防与诊断、食品分析等领域具有重要作用[24]。目前多个研究小组利用核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料实现了对ATP的检测。Song等[25]将上转换纳米颗粒作为供体，羧基四甲基罗丹明(TAMRA)作为受体设计了核酸适配体生物传感器，利用供受体之间的能量共振转移实现了对ATP的检测，检测限为20 μmol/L。He等[26]基于SiO2包裹的上转换纳米颗粒和两段核酸适配体片段构建了一种高灵敏度的共振能量转移体系，用于ATP的检测，检测限为1.70 μmol/L。为了进一步提高检测灵敏度，Liu[27]等采用氧化石墨烯作为能量受体，基于核酸适配体功能化上转换纳米材料和氧化石墨烯之间的能量共振转移构建了高灵敏度的生物传感平台，实现了对ATP的检测，检测限达到80 nmol/L。在这个设计中，核酸适配体与氧化石墨烯之间的吸附作用使NaYF4∶Yb,Er的上转换发光几乎全被猝灭，加入ATP后，核酸适配体与ATP结合从氧化石墨烯表面脱离，上转换发光恢复，从而达到检测ATP的目的。这些基于共振能量转移的核酸适配体功能化上转换纳米探针实现了对ATP的快速、高特异性、高灵敏度检测，能够被应用于细胞生命活动的研究和疾病诊断中。

2.1.2真菌毒素真菌毒素是真菌在食品或饲料中生长所产生的次级代谢产物，对人和动物都有极大的危害[28]。直接或间接方式摄入真菌毒素会产生急慢性中毒、致癌性等危害，若长期被人们摄入，具有潜在的致肝癌、胃癌、肾癌等的可能性[29]。江南大学王周平教授课题组开展了一系列利用核酸适配体修饰的上转换纳米颗粒检测毒素物质的研究工作，拓展了上转换纳米材料在分析检测中的应用。该课题组利用上转换纳米颗粒与纳米金之间的共振能量转移实现了伏马菌毒素B1(FB1)的检测[30]。他们将上转换纳米颗粒修饰在分子信标一端，纳米金修饰在分子信标的另一端导致上转换发光猝灭，当存在待测物时上转换发光恢复，从而实现FB1的检测。此外，该课题组还通过双色上转换荧光纳米颗粒-氧化石墨烯共振能量转移实现了FB1和赭曲霉毒素A(OTA)的同时检测[31]。具体设计是将FB1和OTA的核酸适配体分别与两种上转换纳米颗粒连接作为供体探针，该探针通过非共价键与氧化石墨烯相连，上转换发光被猝灭，当加入靶标物FB1和OTA后，上转换探针与靶标物结合，上转换发光恢复，实现对两种毒素的同时检测。将核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料用于真菌毒素的检测，拓展了上转换纳米材料在食品分析、环境检测中的应用，对解决食品安全和环境污染问题起到了一定的推动作用。

2.1.3激素激素是一类由高度分化的内分泌细胞合成并直接分泌入血的化学信息物质，它通过调节各种组织的代谢活动影响人体的生理活动[32 - 33]。Guo等[34]构建了基于上转换纳米材料和核酸适配体的电致化学发光适配体传感器，实现了对环境雌激素双酚A的检测。此外，多种激素的同时检测也非常重要。雌二醇和孕酮是一类重要的雌性类固醇激素，两者的浓度及比值可以用来进行先兆流产、异位妊娠等疾病的评估。基于此，我们课题组设计合成了核酸适配体功能化的上转换纳米探针，结合光子晶体基底，构建了对雌二醇及孕酮两种激素同时检测的集成性微器件。除了双酚A、雌二醇和孕酮等激素之外，诸多其他的激素也在生物体中发挥了不可替代的功能，核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料也将为其他激素的检测提供一种高灵敏、高特异性的传感平台。

2.2蛋白质检测

蛋白质是生命活动的主要载体，是生物功能的主要执行者[35]。蛋白质的检测对生命科学研究具有重大意义[36]。刘志洪教授课题组[37]首次利用核酸适配体修饰的上转换纳米材料和碳纳米颗粒之间的共振能量转移实现了人血浆中凝血酶的检测。该小组利用共价作用将核酸适配体修饰在上转换纳米颗粒表面，当无靶标物凝血酶存在时，上转换纳米颗粒与碳球通过π-π相互作用靠近，上转换发光被猝灭；靶标物存在时，适配体与靶标物结合，上转换纳米颗粒与碳球的距离增大，上转换发光恢复，从而实现对凝血酶的检测。此外，该课题组还利用上转换纳米材料和碳纳米颗粒之间的共振能量转移实现了对癌胚抗原和免疫球蛋白的检测。除了以碳纳米颗粒作为受体，Chen等[38]将金纳米棒作为受体，上转换纳米材料作为供体，构建了用于凝血酶检测的共振能量转移体系。Lin等[39]基于上转换纳米颗粒和金纳米棒之间的共振能量转移实现了对血清中血小板源生长因子的检测。相较于溶液体系中蛋白质的检测，基底上蛋白质的检测时基底容易受到背景荧光的干扰，从而影响检测灵敏度。为了解决这一问题，我们课题组[40]开发了基底上潜指纹中溶菌酶的检测方法，将氨基修饰的溶菌酶核酸适配体修饰到上转换纳米颗粒表面，构建了高特异性和无背景荧光干扰的指纹中溶菌酶检测探针。由于基底中的荧光物质不能被近红外光激发，故该探针能有效消除背景荧光的干扰。此外，通过改变核酸适配体的种类，该探针还适用于指纹中其它标志物的检测。我们开发的方法有效解决了传统指纹中标志物检测方法所面临的特异性差和易受背景荧光干扰这两方面的问题，有望在医疗诊断、刑事侦查等领域得到更进一步的应用。

2.3 核酸检测

核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，既是生物的基本遗传物质，也是基因表达的基础[41]。核酸分子与生物的生长、发育、疾病、衰老等活动息息相关，其检测对多种疾病的诊断、基因治疗、药物筛选等领域有着非常重要的意义[42]。Cristobal等[43]基于上转换纳米颗粒和氧化石墨烯的共振能量转移构建了高灵敏度的DNA传感器。在该设计中，上转换纳米颗粒表面的单链DNA可以与氧化石墨烯结合使得上转换发光被猝灭，当靶标DNA存在时，上转换纳米颗粒表面的DNA单链与靶标物杂交形成双链，氧化石墨烯与上转换颗粒分离，上转换的发光恢复，实现对DNA的检测。Laurenti等[44]基于石墨烯量子点和单链DNA修饰的上转换纳米颗粒构建了特定miRNA序列的检测平台。无目标miRNA序列时，单链DNA修饰的上转换纳米颗粒与石墨烯量子点结合，增强了上转换发光；目标miRNA序列存在时，其与单链DNA杂交形成双链DNA，阻碍了上转换纳米颗粒和石墨烯量子点的结合，上转换发光强度降低，从而实现了对目标miRNA序列的检测，检测限低至10 fmol/L。我们课题组[45]基于不同激发和发射波长的稀土上转换纳米材料构建了可以同时检测多种疾病相关mRNA的可视化检测平台。我们将靶向两种mRNA的上转换纳米探针负载在光子晶体基底上，利用上转换颗粒表面DNA分子与氧化石墨烯的结合作用猝灭上转换纳米探针的发光。在靶标mRNA存在条件下，相应的上转换纳米探针表面的DNA分子与mRNA杂交形成双链，探针与氧化石墨烯分离，上转换发光得到恢复，实现了对两种疾病相关mRNA的同时检测，该工作对癌症早期的诊断以及生命科学具有重要意义。

2.4 病原微生物检测

病原微生物是一类能引起人类和动植物病害的微生物[46]，它会引起感染甚至传染病，对人类和动植物的健康造成极大的危害，开发快速、灵敏、成本低的病原微生物检测方法对人类健康至关重要[47]。Jin等[48]基于上转换纳米颗粒和金纳米棒之间的共振能量转移构建了检测大肠杆菌的适体传感器，无靶标物时，上转换纳米颗粒表面的DNA单链与金纳米棒表面的核酸适配体杂交，上转换发光被猝灭，加入靶标物后，核酸适配体与靶标物结合，上转换发光恢复，实现对大肠杆菌的检测。王周平教授课题组[49]首次展开了多色上转换发光颗粒同时标记检测多组分毒素物质的研究，利用双色上转换发光标记-磁分离适配体识别技术实现了对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的同时检测。该设计中将上转换纳米材料标记的适配体作为显示探针，适配体功能化的磁性材料作为捕获探针，构建了一种“三明治”夹心型同时检测鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的新方法。此外，该课题组还建立了利用双色上转换发光标记-磁分离技术同时检测两种手足口病病毒的方法[50]，将两种上转换纳米颗粒与特定核酸序列连接构成信号探针，同时将磁性纳米颗粒分别与特定核酸序列连接构成捕获探针，实现了对手足口病病毒EV-71和CV-A16的同时检测。病原微生物具有种类繁多、遗传变异快等特点，与操作复杂、检测周期长的传统检测方法相比，利用核酸适配体功能化的稀土上转换纳米颗粒检测病原微生物具有操作简单、灵敏度高等优势。

2.5 细胞检测

细胞是构成生物体的基本结构单元，同时也是疾病形成过程中致病的基本单元[51]。细胞的分析检测对于生物工程、疾病诊断具有重要意义[52]。刘庄教授课题组[53]首次提出了将上转换发光材料与核酸适配体结合作为纳米探针检测循环肿瘤细胞CTCs(CCRF-CEM细胞)，并且利用磁性纳米材料将检测到的循环肿瘤细胞进行了有效分离。他们首先在上转换纳米材料表面修饰了PEG-PMHC18后，再结合上生物素和核酸适配体，形成能特异性识别循环肿瘤细胞的共聚物，进一步利用生物素和亲和素的特异性结合，加入修饰亲和素的超顺磁Fe3O4，最后用磁铁分离出循环肿瘤细胞。Wang等[54]基于稀土上转换纳米材料和核酸适配体构建了一个近红外光驱动的光电适配体传感器，实现了对乳腺癌细胞MCF-7的检测。将核酸适配体功能化的稀土上转换纳米颗粒用于癌细胞的检测，是一种有潜力的、具有高特异性和高灵敏度、简便可行的方法，对未来肿瘤临床诊断具有重大的意义。

3 展望

近年来，核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料在生物检测领域得到了广泛的应用，表现出灵敏度高、选择性好、简便、快速等优势，然而还存在一些问题有待解决：

(1)稀土上转换纳米材料的发光效率低，并且随着颗粒尺寸减小，发光效率降低，限制了其在分析检测以及荧光成像等方面的应用。

(2)为了提高稀土上转换纳米材料水溶液体系中的分散性，扩展其在生物医学领域的应用，对颗粒表面进行修饰是非常必要的，目前常用的表面修饰方法有表面配体交换法、包裹法等，在颗粒表面修饰一层或多层官能基团，使得修饰后的纳米颗粒具有亲水/疏水性或便于连接DNA、抗体/抗原等以实现特殊的生物功能。然而目前要实现在颗粒表面定量可控地修饰配体仍比较困难。此外，通过在上转换纳米颗粒表面修饰多种配体以实现材料的多功能化仍然存在着很大挑战。

(3)目前用于构建适配体传感器的核酸适配体种类仍十分有限，大部分研究工作都限制于一些常见的核酸适配体，这限制了其在生物传感领域的应用。随着SELEX等生物技术的发展，越来越多种类的核酸适配体将被筛选出来，大大促进其在生物传感领域的发展。

随着这些问题的解决和完善，核酸适配体功能化的稀土上转换纳米材料将会进一步提高检测灵敏度、扩展更宽的检测对象范围，在生物分析领域实现更加广泛、深入的应用。