HCN通道的结构与功能及其功能调节相关的细胞分子机制研究进展

张文娟，曾晓莉,2，赵博，何治

(1三峡大学医学院，湖北宜昌443002；2湖北三峡职业技术学院医学院)

HCN通道的结构与功能及其功能调节相关的细胞分子机制研究进展

张文娟1，曾晓莉1,2，赵博1，何治1

(1三峡大学医学院，湖北宜昌443002；2湖北三峡职业技术学院医学院)

超极化激活环核苷酸阳离子门控通道(HCN通道)参与许多重要的生理活动，包括窦房结自律性、学习和记忆、突触神经递质释放、树突整合等，并且与癫痫、神经病理性疼痛、脑血管疾病的发生、发展存在一定关联。HCN通道除受细胞内cAMP调节外，还受细胞内外小分子物质(cGMP、cCMP及离子、磷脂酰肌醇丝氨酸)、蛋白质(小分子蛋白、蛋白激酶)及一些神经递质(谷氨酸、γ-氨基丁酸、乙酰胆碱、神经肽类物质、去甲肾上腺素、单胺类神经递质、NO、嘌呤类神经递质)的调节，这些物质除了调节HCN通道的开放以外，还调控该通道的表达、分布及功能特性，从而发挥相应的生理功能。

超极化激活环核苷酸阳离子门控通道；电生理功能；细胞分子机制

超极化激活环核苷酸阳离子门控通道(HCN通道)最早在兔的窦房结中被发现，随后在海马CA1区锥体细胞中也有发现，可介导超级化激活的内向非特异性电流Ih。研究表明，HCN通道参与许多重要的生理活动，如窦房结自律性、学习和记忆、突触神经递质释放、树突整合等，并且与癫痫、神经病理性疼痛、脑血管疾病发生、发展存在一定的关联[1]。本文就HCN通道的结构与功能及其功能调节相关细胞分子调节机制作一综述。

1 HCN通道的结构与功能

HCN通道有4种亚型，分别为HCN1～HCN4，4种亚型的结构非常相似，均由同源或异源四聚体聚合而成。HCN通道与电压门控的钾通道具有高度同源性，均介导超级化激活的内向非特异性电流。HCN通道的分子结构是一种跨膜的膜蛋白，由3个重要的模块组成，包含6个跨膜核心区、COOH-末端和NH2-末端。6个跨膜核心区分别称为 S1～S6，该区域有两个重要的功能区域，即能感受正电荷的电压感受区域S4和特殊的小孔结构P区 。HCN分子在胞内区的NH2-末端是糖基化位点，与S1相连接，只有在发生糖基化以后该通道才能发挥作用。在与S6连接的COOH-末端还含有一个特殊的结构区域，即环核苷酸结合区(CNBD)，该结构能与cAMP直接结合，通过其在细胞内水平变化来调控通道开放[2]。HCN通道的分布主要集中于心脏和神经系统，具备有许多生理功能：①稳定静息膜电位；②突触整合；③抑制海马长时程，参与学习记忆；④参与循环系统传导；⑤参与丘脑自发节律调节等[3]。

2 HCN通道功能调节相关的细胞分子机制

2.1 HCN通道功能调节相关的小分子物质

2.1.1 cAMP、cGMP及cCMP cAMP是HCN通道调控的重要分子，能超极化激活HCN通道。Chow等[4]发现，在缺乏或是抑制cAMP表达的动物模型中，HCN通道的COOH-末端连接区会被抑制，限制HCN通道S6区移动，使通道的内在活性被减弱；而提高cAMP浓度后，其与通道CNBD区结合发生变构效应， COOH-末端连接区的抑制作用得到缓解，HCN通道被激活。cGMP与cCMP结合的亲和力虽不及cAMP，但也可以使CNBD区发生变构效应，从而促使HCN通道激活[5]。

2.1.2 离子 ①质子：HCN通道激活与细胞内、外的质子也存在密切关系。HCN通道分子结构的S4与S5连接区存在组氨酸残基位点，该位点能感受细胞内外pH值的变化[6]。②Cl-：HCN通道也受Cl-的调节，主要研究集中在心脏功能方面，具体机制目前尚不清楚。研究显示，Cl-对HCN通道的调节与心率存在一定关系，可能与HCN通道对窦房结自律性的调节有关[7]。

2.1.3 磷脂酰肌醇丝氨酸(PIP2) 除cAMP外，PIP2也是HCN通道的变构激活剂，能使HCN通道发生变构效应而被激活。PIP2能作用于HCN通道的电压感应区域，其激活的曲线向去极化方向偏移约20 mV，使HCN通道电压依赖性门控孔道在不依赖环磷酸腺苷的情况下处于稳定化或活化状态[8]。

2.2 HCN通道功能调节相关的蛋白质

2.2.1 小分子蛋白 一些小分子蛋白也与HCN通道的调控密切相关，其能通过与HCN通道COOH-末端的相互作用来介导HCN通道开放，如肌动结合蛋白APB-280(Filamin A)、脑特异性胞质蛋白TRIP8b。Gravante等[9]研究发现，Filamin A能通过与CNBD区下游的含22个氨基的酸性区域结合来调控HCN1通道表达，表明Filamin A是HCN1通道的特异性调节因子。Piskorowski等[10]研究发现，TRIP8b(1a-4)能使COOH-末端的CNBD区发生变构效应，从而促进树突表达HCN1，但TRIP8b(1a)却可以下调HCN1通道表达，这种相反调节作用可能是为了防止HCN1通道的错误表达。

2.2.2 蛋白激酶

2.2.2.1 酪氨酸激酶(SRC) SRC是HCN通道的重要调节因子。SRC激酶介导酪氨酸磷酸化，其在窦房结起搏细胞、心肌细胞以及神经元均有表达。研究表明，SRC能够通过SH3结构域来调控HCN通道开放[11]。在氙卵母细胞和天然组织中应用酪氨酸激酶抑制剂染料木素可以降低HCN通道活化，降低Ih诱导的幅度[12]。

2.2.2.2 p38MAPK p38MAPK属于分裂原激活的蛋白激酶，是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中一员，是信号转导过程中的主要信号分子。研究发现，降低海马神经元CA1区p38MAPK活性会抑制树突中的HCN通道开放，使Ih电流减少，从而导致癫痫发生，说明p38MAPK可能通过调控HCN通道而参与癫痫的发生[13]。

2.2.2.3 蛋白激酶C(PKC) PKC是神经递质的重要下游靶标，之前研究认为其激活能抑制HCN通道[14,15]，但近期有研究证实PKC激活可双向调控HCN通道[16]。该研究在海马CA1锥体神经元内活化PKC后发现HCN1通道表达减少，Ih振幅被抑制，但HCN相关的丝氨酸磷酸化状态反而增强，说明PKC激活对HCN通道的表达存在双向调控作用。

2.3 HCN通道功能调节相关的神经递质

2.3.1 谷氨酸 谷氨酸是一种兴奋性神经递质，包含离子型谷氨酸受体和代谢性谷氨酸受体。Noam等[17]研究发现，谷氨酸能够激活离子型谷氨酸受体N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)受体，导致钙离子超载、HCN1表达升高。Bender等[18]发现，谷氨酸能够通过Ca2+/CaMKⅡ信号通路激活神经元限制性沉默因子(NRSF)，从而抑制HCN1通道转录；另一方面，谷氨酸能与代谢型谷氨酸受体m1GluRs结合，通过激活下游PLC-PKC信号途径来抑制HCN通道。

2.3.2 γ-氨基丁酸(GABA) GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，其受体分为GABAA、GABAB、GABAC三种亚型。Mcquail等[19]发现，GABA信号通路与年龄相关的认知功能降低密切相关。Luo等[20]研究证实，GABAB激动剂巴氯芬能通过上调大鼠神经元中HCN2通道表达来改善其学习记忆功能。

2.3.3 乙酰胆碱(Ach) Ach通过激活不同类型的mAchR来改变Ih的功能，其既能够上调Ih也能下调Ih，但通常对Ih发挥抑制作用。Heys等[21]研究发现，Ach能与mAchR受体结合并偶联至G蛋白Gi，抑制腺苷酸环化酶(AC)活性，降低cAMP水平，从而导致Ih下调，使运动相关神经元兴奋性降低，限制了运动过程中某些神经元的参与。

2.3.4 神经肽类物质 HCN通道能通过多种神经肽进行调节，这些神经肽类物质包括食欲素、阿片样肽、神经肽Y、血管活性肠肽(VIP)、神经降压素、血管紧张素Ⅱ和物质P等，其能通过介导抑制腺苷酸环化酶(AC)而降低细胞内cAMP水平或通过激活磷脂肌醇信号途径(PLC-PKC)来降低Ih幅度，从而调节HCN通道[22]。

2.3.5 单胺类神经递质 去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)和多巴胺等单胺能神经递质能影响神经元兴奋性、突触传递、整合和可塑性。Wang等[23]发现，NE能通过抑制AC降低cAMP水平，从而抑制HCN通道活化。另有研究表明，可卡因能促进中脑腹侧盖区(VTA)多巴胺的释放，激活多巴胺受体后偶联至G蛋白Gi，使cAMP水平下降，导致Ih电流振幅下调，从而增强可卡因的药物成瘾性[24]。

2.3.6 NO NO虽然是一种气体，但也是神经系统重要的神经递质，在突触后或突触前神经传递调节中发挥重要作用。Wenker等[25]使用穿孔补丁记录技术发现，NO能够诱导HCN通道激活，使Ih幅度发生可逆性增加；该研究还发现NO对HCN通道的调节除了潜在的cGMP依赖效应外，还可能存在硝基化的调节作用。

2.3.7 嘌呤类神经递质 ATP及其降解产物腺苷在一些突触中属于嘌呤能神经递质，两者能够通过调节HCN通道的活性影响神经元兴奋性，共同参与广泛的神经系统活动。Huang等[26]研究发现，ATP可能通过G介导蛋白偶联的二磷酸腺苷受体受体调节Ih幅度，从而影响中枢感觉神经的转导。

综上所述，HCN通道参与并介导了多种重要的生理功能，与很多疾病的发生、发展密切相关。该通道自发现以来的短短几十年里，学者们便对其结构、分布、亚型、表达及功能进行了较为系统的研究。近年来，随着基因敲除和分子克隆技术的发展，人们已经成功克隆出HCN的4种亚型，对HCN通道功能调节的细胞分子机制研究也更加深入，为进一步研究相关疾病的发生、发展机制提供理论基础。

[1] Brennan GP, Baram TZ, Poolos NP. Hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated (HCN) channels in epilepsy[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2016, 6(3):22384.

[2] Lee CH, Mackinnon R. Structures of the human HCN1 hyperpolarization activated channel[J]. Cell, 2017,168(1-2):111-120.

[3] 王巍,冯加纯.超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道与神经疾病关系的研究进展[J].中风与神经疾病杂志,2012,29(10):940-942.

[4] Chow SS, Van PF, Accili EA. Energetics of cyclic AMP binding to HCN channel C terminus reveal negative cooperativity[J]. J Biol Chem, 2011,287(1):600-606.

[5] Deberg HA, Brzovic PS, Flynn GE, et al. Structure and energetics of allosteric regulation of HCN2 Ion channels by cyclic nucleotides[J]. J Biol Chem, 2016,291(1):371-381.

[6] Carlson AE, Rosenbaum JC, Brelidze TI, et al. Flavonoid Regulation of HCN2 Channels[J]. J Biol Chem, 2013,288(46):33136-33145.

[7] Mistrík P, Pfeifer A, Biel M. The enhancement of HCN channel instantaneous currentfacilitated by slow deactivation is regulated by intracellular chloride concentration[J]. Pflügers Arch, 2006,452(6):718-727.

[8] Williams AD, Jung S, Poolos NP. Protein kinase C bidirectionally modulates Ih and hyperpolarization activated cyclic nucleotidegated (HCN) channel surface expression in hippocampal pyramidal neurons[J]. J Physiol, 2015,593(13):2779-2792.

[9] Gravante B, Barbuti A, Milanesi R, et al. Interaction of the pacemaker channel HCN1 with filamin A[J]. J Biol Chem, 2004,279(42):43847-43853.

[10] Piskorowski R, Santoro B, Siegelbaum SA. TRIP8b splice forms act in concert to regulate the localization and expression of HCN1 channels in CA1 pyramidal neurons[J]. Neuron, 2011,70(3):495-509.

[11] Wu JY， Cohen IS. Tyrosine kinase inhibition reduces i( f) in rabbit sinoatrial node myocytes[J] .Pflugers Arch, 1997,434(3):509-514．

[12] Yu HG, Lu Z, Pan Z, et al. Tyrosine kinase inhibition differentially regulates heterologously expressed HCN channels[J]. Pflugers Arch, 2004,447(4):392-400.

[13] Jung S, Bullis JB, Lau IH, et al. Downregulation of dendritic HCN channel gating in epilepsy is mediated by altered phosphorylation signaling.[J]. J Neurosci, 2010,30(19):6678-6688.

[14] Brager DH, Johnston D. Plasticity of intrinsic excitability during long-term depressi-on is mediated through mGluR-dependent changes in I(h) in hippocampal CA1 pyramidal neurons[J]. J Neurosci, 2007,27(51):13926-13937

[15] Li B, Chen F, Ye J, et al. The modulation of orexin A on HCN currents of pyrami-dal neurons in mouse prelimbic cortex[J]. Cerebral Cortex, 2010,20(7):1756-1767

[16] Flynn GE, Zagotta WN. Molecular Mechanism Underlying Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate-induced Inhibition of SpIH Channels[J]. J Biol Chem, 2011,286(17):15535-15542.

[17] Noam Y, Zha Q, Phan L, et al. Trafficking and surface expression of hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated channels in hippocampal neurons[J]. J Biol Chem, 2010,285(19):14724-14736.

[18] Bender RA, Kirschstein T, Kretz O, et al. Localization of HCN1 channels to presynaptic compartments: novel plasticity that may contribute to hippocampal maturation[J]. J Neurosci, 2007,27(17):4697-4706.

[19] Mcquail JA, Frazier CJ, Bizon JL. Molecular aspects of age-related cognitive decline: the role of GABA signaling[J]. Trends Mol Med, 2015,21(7):450-460.

[20] Luo P, Chen C, Lu Y, et al. Baclofen ameliorates spatial working memory impairments induced by chronic cerebral hypoperfusion via up-regulation of HCN2 expression in the PFC in rats[J]. Behav Brain Res, 2016,308:6-13.

[21] Heys JG, Giocomo LM, Hasselmo ME. Cholinergic modulation of the resonance properties of stellate cells in layer Ⅱ of medial entorhinal cortex[J]. J Neurophysiol, 2010,104(1):258-270.

[22] Zhang S, You Z, Wang S, et al. Neuropeptide S modulates the amygdaloidal HCN activities (Ih) in rats: implication in chronic pain[J]. Neuropharmacology, 2016,105:420-433.

[23] Wang M, Ramos BP, Paspalas CD, et al. Alpha2A-Adrenoceptors strengthen working memory networks by inhibiting cAMP-HCN channel signaling in prefrontal cortex[J]. Cell, 2007,129(2):397-410.

[24] Arencibia-Albite F, Vázquez R, Velásquez-Martinez MC, et al. Cocaine sensitization inhibits the hyperpolarization activated cation current Ih and reduces cell size in dopamine neurons of the ventral tegmental area[J]. J Neurophysiology, 2012,107(8):2271-2282.

[25] Wenker IC, Benoit JP, Chen X, et al. Nitric oxide activates hypoglossal motoneurons by cGMP-dependent inhibition of TASK channels and cGMP-independent activati-on of HCN channels[J]. J Neurophysiology, 2012,107(5):1489-1499.

[26] Huang W, Xiu Y, Yan JA, et al. Facilitation of Ih channels by P2Y1 receptors activation in Mesencephalic trigeminal neurons[J]. Neurosci Lett, 2010,482(2):156-159.

国家自然科学基金资助项目(81371318)；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划(T201403)。

何治(E-mail: hezhi2003@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.033

R696

A

1002-266X(2017)44-0101-03

2017-04-30)