维生素D受体基因ApaⅠ、TaqⅠ多态性与青藏高原藏族儿童结核病易感性的关系

张弢，王淼舟，张艳虹，朱国龙，李天如

(1青海省妇女儿童医院，西宁810007；2青海大学附属医院)

·临床研究·

维生素D受体基因ApaⅠ、TaqⅠ多态性与青藏高原藏族儿童结核病易感性的关系

张弢1，王淼舟2，张艳虹1，朱国龙1，李天如1

(1青海省妇女儿童医院，西宁810007；2青海大学附属医院)

目的探讨维生素D受体基因ApaⅠ、TaqⅠ多态性与青藏高原藏族儿童结核病易感性的关系。方法选择青藏高原藏族活动性肺结核患儿162例(观察组)和有分枝杆菌接触史的青藏高原藏族健康儿童167例(对照组)，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法检测两组外周血维生素D受体基因ApaⅠ、TaqⅠ多态性。结果观察组ApaⅠ基因型为AA、Aa、aa者分别为10例(6.2%)、72例(44.5%)、80例(49.4%)，对照组分别为22例(13.2%)、79例(47.3%)、66例(39.5%)，观察组aa基因型频率高于对照组(P<0.05)。观察组A、a等位基因频率分别为28.4%、71.6%，对照组分别为36.8%、63.2%，两组A、a等位基因频率比较P均<0.05。观察组TaqⅠ基因型为TT、Tt、tt者分别为138例(85.2%)、24例(14.8%)、0例，对照组分别为146例(87.4%)、21例(12.6%)、0例，两组TaqⅠ基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组T、t等位基因频率分别为92.6%、7.4%，对照组分别为93.7%、6.3%，两组T、t等位基因频率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论维生素D受体基因ApaⅠ多态性与青藏高原藏族儿童肺结核易感性相关，其aa基因型可能是发病相关因素；TaqⅠ多态性与青藏高原藏族儿童肺结核易感性无关。

维生素D受体；ApaⅠ基因；TaqⅠ基因；肺结核；藏族；青藏高原；儿童

结核病的发生、发展及转归除与病原体的致病能力及环境因素有关外，还与宿主遗传因素密切相关[1]。研究显示，结核病的遗传易感性是多基因相关的，相关基因包括人类白细胞抗原(HLA)、非HLA基因、维生素D受体基因、甘露糖结合植物凝集素基因等[2]。藏族居民世居于高原，因交通不便，与外来人口交流少，故结核病菌暴露时间短，历史上受自然选择的影响相对较弱，导致携带结核易感基因的人有更大概率存活并繁殖后代，使结核易感基因得以遗传。故现居高原的藏族居民可能携带较多的结核易感基因[2]。本研究探讨维生素D受体基因ApaⅠ、TaqⅠ多态性与青藏高原藏族儿童结核病易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月～2015年12月青海省妇女儿童医院收治的青藏高原藏族活动性肺结核患儿162例为观察组，其中男72例、女90例，年龄0～16岁。患儿均根据病史、临床表现、细菌学及影像学检查确诊，且除外患有自身免疫性疾病、内分泌系统疾病、HIV感染及长期使用肾上腺皮质激素或其他免疫抑制剂者。选择同期接受健康查体的有结核分枝杆菌接触史的青藏高原藏族健康儿童167例为对照组，其中男76例、女91例，年龄0～16岁。结核菌素试验(PPD)硬结反应平均直径<5 mm，经胸透无异常发现，随访1年未发现罹患结核。本研究通过医院伦理委员会审核，受试者监护人均知情同意。

1.2 外周血维生素D受体基因ApaⅠ、TaqⅠ多态性检测 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析法。抽取两组外周血200 μL，以DNeasy Blood & Tissue Kit从血中分离白细胞，并获得DNA。行PCR扩增，步骤严格按照试剂盒说明书进行。ApaⅠ上游引物为5′-TCAAGTTCCAGGTGGGACTGA-3′， 下游引物为5′-CAAGGG-

TCACTGCACATTGCT-3′。TaqⅠ上游引物为5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3′，下游引物为5′-CACTTCGAGCACAAGGGGCGTTAG-3′。PCR反应体系15 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃延伸5 min。用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物浓度。以ApaⅠ内切酶及TaqⅠ内切酶对维生素D受体基因的两种多态性进行分型，前者分为AA、Aa、aa三种基因型，后者分为TT、Tt、tt三种基因型。酶切产物以2.5%琼脂糖凝胶电泳(90 V电压)分离酶切片段，用0.5 μg/mL溴乙锭染色后在凝胶成像系统下观察并确定基因型。维生素D受体ApaⅠ基因型AA型为纯合子，酶切得到长度501 bp的一个片段；aa型为纯合子，酶切得到长度284、217 bp的两个片段；Aa为杂合子，酶切得到长度501、284、217 bp的三个片段。TaqⅠ基因TT型为纯合子，酶切得到长度494 bp的一个片段；Tt型为杂合子，酶切得到长度494、293、201 bp的三个片段；tt型为纯合子，酶切得到长度293、201 bp的两个片段。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。基因型及等位基因频率均以率表示，结果比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组ApaⅠ基因型为AA、Aa、aa者分别为10例(6.2%)、72例(44.5%)、80例(49.4%)，对照组分别为22例(13.2%)、79例(47.3%)、66例(39.5%)，观察组aa基因型频率高于对照组(P<0.05)。观察组A、a等位基因频率分别为28.4%、71.6%，对照组分别为36.8%、63.2%，两组A、a等位基因频率比较P均<0.05。观察组TaqⅠ基因型为TT、Tt、tt者分别为138例(85.2%)、24例(14.8%)、0例，对照组分别为146例(87.4%)、21例(12.6%)、0例，两组TaqⅠ基因型频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组T、t等位基因频率分别为92.6%、7.4%，对照组分别为93.7%、6.3%，两组T、t等位基因频率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

3 讨论

近年来随着分子生物学研究的进展，遗传因素在结核发生、发展中的作用得到证实[3]。维生素D受体是一种亲核蛋白，属于类固醇激素、甲状腺受体超家族的成员，在维持机体钙磷代谢、调节骨骼代谢方面具有重要作用，同时也与结核的发生、发展相关[4,5]。本研究结果显示，两组维生素D受体基因TaqⅠ各基因型频率和等位基因频率无统计学差异，维生素D受体基因ApaⅠ多态性的各基因型频率差异有统计学意义，aa基因型可能是发病相关因素。

维生素D受体基因ApaⅠ的多态性位点位于VDR基因3′的第8内含子处，可发生A/C转换，但其多态性不影响氨基酸的编码序列[6]。Bornman等[7]研究结果显示，维生素D受体基因ApaⅠ多态性与西非患者结核易感性相关。而Lee等[8]对东亚人维生素D受体基因ApaⅠ多态性与结核易感性关系进行的Meta分析结果显示，维生素D受体基因ApaⅠ多态性与结核病无关，与Soborg等[9]对东非坦桑尼亚人群进行的研究结果相似。本研究结果显示，ApaⅠ多态性与藏族儿童结核发病具有相关性，提示该位点多态性导致结核的发生可能与民族、环境有一定关系。TaqⅠ多态性位点位于维生素D受体基因3′的第9外显子中，可发生T/C突变，但这是一种同义突变，并不影响氨基酸的编码顺序。有研究显示，TT基因型患者维生素D受体基因在mRNA和蛋白水平表达量较tt基因型者分别高25.8%和62.9%[10]。Cao等[11]对东亚及西亚人进行的Meta分析显示，维生素D受体基因TaqⅠ多态性与结核具有相关性。而Lee等[8]对东亚人维生素D受体基因TaqⅠ多态性与结核易感性的关系进行了Meta分析，结果显示二者不具有相关性，因此推测TaqⅠ位点多态性可能亦与民族及环境有关。

综上所述，青藏高原藏族儿童维生素D受体基因ApaⅠ多态性与结核易感性有关，而TaqⅠ多态性与结核易感性没有相关性。本研究结果与其他民族有一定差异性，可能是青藏高原藏族人群的特点之一。

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青海省科技计划项目(2013-Z-740)。

王淼舟(E-mail： 18609780039@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.015

R725.6

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1002-266X(2017)44-0051-03

2016-11-10)