磷脂酰丝氨酸红细胞与β地中海贫血高凝状态关系的研究进展

刘徽，邓东红，程鹏

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

磷脂酰丝氨酸红细胞与β地中海贫血高凝状态关系的研究进展

刘徽，邓东红，程鹏

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

β地中海贫血是一种遗传性血红蛋白病，其特征为β珠蛋白链合成减少或缺乏。红细胞内过多的α珠蛋白链不能与β珠蛋白链结合，形成不可逆的高铁血红素结合到细胞膜的胞质面。细胞膜蛋白和脂质氧化损伤，使红细胞膜磷脂不对称性丧失，导致红细胞各种膜缺陷和磷脂酰丝氨酸(PS)外翻。研究表明，红细胞膜脂质过氧化伴随PS外翻可在β地中海贫血的高凝状态及血栓栓塞风险中发挥病理作用。红细胞膜表面PS暴露，倾向于在循环中产生促凝血微粒；且PS红细胞与血小板及内皮细胞相互作用促进凝血酶生成。

β地中海贫血；磷脂酰丝氨酸；高凝状态；血栓栓塞

红细胞膜是脂质和蛋白质的复杂组合物。数以百计的磷脂分子自发地排列在脂质双层中，以动态和高度有条理的方式在质膜平面和(或)跨越磷脂双层的位置快速移动[1]。磷脂不对称地分布在脂质双层膜上，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞质膜内小叶。然而β地中海贫血循环中存在正常的脂质组成和组织丧失的红细胞亚群， PS在细胞膜表面暴露[2]。这可导致红细胞具有促凝血活性，与其他血细胞和血浆成分的相互作用发生变化。在不规律输血或经脾切除术的β地中海贫血患者中，血栓形成事件更为频繁，使血液循环中的损坏红细胞具有促凝血活性[3]。本文对PS红细胞与β地中海贫血高凝状态关系的研究进展作以下综述。

1 红细胞膜磷脂不对称分布及维持机制

红细胞质膜的胞外面及胞质面脂质组成不同：外小叶主要包含中性胆碱磷脂，而氨基磷脂大多存在于细胞质膜内小叶中。红细胞脂质双层中磷脂不对称性在整个细胞周期中保持良好，大部分磷脂酰乙醇胺(PE)和全部的PS分布在胞膜内小叶[1]。维持跨膜脂质不对称分布有三种监管机制。ATP依赖的氨基磷脂转位酶通过逆电化学梯度将PS和PE从外部小叶向内部小叶中快速转运，并使其定位于内部小叶中[4]。氨基磷脂转位酶的活性可以被高浓度Ca2+抑制。另外一种特异性较小的需要ATP的脂质磷酸转移酶，可以将磷脂缓慢地移动到外叶。此外，除以上两种需要ATP来转运脂质的蛋白，爬行酶是ATP非依赖Ca2+依赖酶，其有助于所有磷脂的双向跨膜运动，使磷脂的不对称性崩溃[4]。在生理条件下，生物膜的磷脂不对称性分布通过激活氨基磷脂转位酶和脂质磷酸转移酶及抑制爬行酶活性维持[4,5]。红细胞膜上的磷脂经脂质磷酸转移酶的作用持续且缓慢地移动到外部小叶，而氨基磷脂PS和PE则通过氨基磷脂转位酶迅速地穿梭回内叶。

2 β地中海贫血红细胞PS外翻

在β地中海贫血疾病中，胞质中过量的α-珠蛋白链是不稳定的，倾向于在红细胞膜胞质面氧化沉淀转化为高铁血红素。血红素和蛋白质最终分解，释放毒性物质铁氧化膜脂质并损伤膜功能。同时，分解的氧化活性物质可激活Ca2+非选择性阳离子通道，细胞内Ca2+浓度升高激活爬行酶，从而导致细胞膜表面PS外翻[6]。β地中海贫血红细胞较正常红细胞对休克、氧化应激和能量耗尽更敏感，因为这些条件下可增加Ca2+通道活性使PS暴露增多[7]。

3 PS红细胞和β地中海贫血高凝状态的关系

3.1 PS红细胞高聚集 红细胞的聚集性在血液流动中起着重要作用，尤其是在静脉血管和微循环中。PS红细胞膜脂质及蛋白质氧化受损，聚集性明显增强，易于形成较大的簇。经血细胞图像分析，这些簇形成线性排列的堆叠细胞或三维聚集体[8]。这些聚集体需要较高的剪切力来分散，可导致下肢静脉血液黏度和流体动力学阻力增加。因此β地中海贫血中红细胞聚集增多促进静脉血栓形成[9]。

3.2 PS红细胞的变形性 正常红细胞具有显著的变形性，可使流动阻力最小化。然而β地中海贫血PS红细胞细胞骨架损害及胞质黏度降低使细胞僵硬和变形能力下降，较难经挤压通过毛细血管，增加血栓形成的易感性[10]。变形能力低的红细胞可引起已经形成的血栓和血凝块渗透性下降，导致纤溶酶原不易进入血凝块阻碍纤维蛋白溶解[10]。

3.3 PS红细胞和凝血酶生成 凝血过程中需要带有负电荷的磷脂膜表面，负电荷的磷脂优选PS，其通常由血小板提供。在正常条件下，血液中红细胞没有这样的膜表面。但在β地中海贫血病理条件下，红细胞表面PS异常外翻，代替血小板的功能诱导血液凝固。研究发现，β地中海贫血血浆中凝血酶抗凝血酶复合物水平升高，且与PS红细胞具有良好的相关性[11]。PS红细胞在凝血酶生成的过程中起催化剂作用。另一研究中使用膜联蛋白V高亲和力及特异性结合红细胞膜表面PS，发现其以剂量依赖的方式抑制β地中海贫血红细胞的促凝血活性。当膜联蛋白V达到纳摩尔浓度时，其抑制作用可以达到95%以上[12]。因此，β地中海贫血红细胞PS外翻对凝血过程具有重要的作用，促进血栓前状态的形成。虽然PS红细胞可以代替血小板的功能促进凝血酶的形成，但是催化过程中的中间产物是有区别的。凝血酶原激活的过程中可以产生中间体凝乳酶原或凝血酶原-2[13]。凝乳酶原作为蛋白C活化剂的抗凝血潜力与凝血酶原-2相似，但是凝乳酶原对促凝剂底物纤维蛋白原、血小板及凝血因子Ⅴ的活性较差；对抗凝血酶的易感性降低，并且是更有效的血管收缩剂[14]。研究发现35%的的凝血酶原由非血小板表面激活；而且在PS红细胞表面可以检测到凝乳酶原释放。因此，激活凝血的过程中，红细胞参与凝血酶的产生，其提供PS外翻的膜表面使凝血酶原通过凝乳酶原途径激活。通过凝乳酶原途径激活的凝血酶原较凝血酶原-2途径产生的凝血酶原活性更高，对凝血反应具有放大作用，使β地中海贫血患者血液凝固性异常增高[14,15]。

3.4 PS红细胞及其衍生的微粒(MP) MP是来源于不同细胞脱落的小膜囊泡，血液循环中含有衍生于红细胞、血小板和单核细胞的MP。PS存在于细胞膜外通常是可以促进膜泡的形成和亚微囊泡的释放[16]。β地中海贫血患者血液循环中有高水平的红细胞MP，且切脾后患者血浆MP水平较未切脾者增高[17]。红细胞MP表面PS促进凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的结合，凝血复合物的组装以及加速凝血酶的形成。此外，红细胞MP可引起凝血因子Ⅻa活性增强[18]，Ⅻa可以与纤维蛋白(或纤维蛋白原)结合，从而不依赖凝血酶而调节血凝块的结构。

3.5 PS红细胞和血小板 血管内红细胞的血液流变学是优先沿着血管中心向下移动，引起血小板边缘化，优先黏附在血管壁的损伤部位[19]。除了促进血小板与损伤血管壁接触活化，PS红细胞可增加体内凝血酶的生成，凝血酶增多反过来可激活血小板，红细胞在血小板活化期间促进血栓形成反馈环路[20]。红细胞膜异常和连续的血小板活化被认为是地中海贫血血栓形成的机制。PS红细胞不仅促进血小板活化而且导致血小板之间的黏附增强[21]。

3.6 PS红细胞和内皮细胞 红细胞PS外露导致细胞-细胞之间相互作用增加，PS红细胞与内皮细胞之间的黏附增加进而激活内皮细胞。Manodori等[22]使用钙离子载体处理正常人的红细胞，促进正常红细胞膜表面PS外翻；使用脐静脉内皮细胞单层与PS红细胞一起孵育时，内皮细胞收缩，红细胞黏附在内皮细胞间的间隙中。用膜联蛋白V屏蔽红细胞膜上的PS位点后，红细胞和内皮细胞之间的黏附作用明显降低。已有文献报道了PS红细胞与内皮细胞黏附的分子机制，红细胞膜PS黏附于内皮细胞基质的血小板反应蛋白，导致红细胞黏附于内皮细胞之间的间隙[22,23]。因此，β地中海贫血中PS红细胞与内皮细胞黏附增加，激活内皮细胞，尤其是微血管内皮细胞，最终导致微循环障碍。

综上所述，红细胞膜表面PS暴露与血栓形成疾病的发生密切相关，可以促进血栓栓塞和增强已形成血栓的稳定性。β地中海贫血红细胞膜的异常可导致细胞本身物理机械性能的改变及促凝血MP释放，与血小板和内皮细胞黏附作用增强，促进凝血酶的生成等均促使血液高凝状态形成。

[1] Kuypers FA, Yuan J, Lewis RA, et al. Membrane phospholipid asymmetry in human thalassemia[J]. Blood, 1998,91(8):3044-3051.

[2] Freikman I, Amer J, Cohen JS, et al. Oxidative stress causes membrane phospholipid rearrangement and shedding from RBC membranes——an NMR study[J]. Biochimi Biophys Acta, 2008,1778(10):2388-2394.

[3] Cappellini MD, Musallam KM, Poggiali E, et al. Hypercoagulability in non-transfusion-dependent thalassemia[J]. Blood Reviews, 2012,26(Suppl 1):s20-s23.

[4] Daleke DL. Regulation of phospholipid asymmetry in the erythrocyte membrane[J]. Curr Opin Hematol, 2008,15(3):191-195.

[5] Bevers EM, Comfurius P, Zwaal RF. Regulatory mechanisms in maintenance and modulation of transmembrane lipid asymmetry: pathophysiological implications[J]. Lupus, 1996,5(5):480-487.

[6] Cao A, Galanello R. Beta-thalassemia[J]. Genetics, 2010,12(2):61-76.

[7] Lang KS, Roll B, Myssina S, et al. Enhanced erythrocyte apoptosis in sickle cell anemia, thalassemia and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency[J]. Cell Physiol Biochem, 2002,12(5-6):365-372.

[8] Baumler H, Neu B, Donath E, et al. Basic phenomena of red blood cell rouleaux formation[J]. Biorheology, 1999,36(5-6):439-442.

[9] Yu FT, Armstrong JK, Tripette J, et al. A local increase in red blood cell aggregation can trigger deep vein thrombosis: evidence based on quantitative cellular ultrasound imaging[J]. JTH, 2011,9(3):481-488.

[10] Du VX, Huskens D, Maas C, et al. New insights into the role of erythrocytes in thrombus formation[J]. Semin Thromb Hemost, 2014,40(1):72-80.

[11] Labib HA, Etewa RL, Atia H. The hypercoagulable status in common Mediterranean beta-thalassaemia mutations trait[J]. Int J Lab Hematol, 2015,37(3):326-333.

[12] Helley D, Eldor A, Girot R, et al. Increased procoagulant activity of red blood cells from patients with homozygous sickle cell disease and beta-thalassemia[J]. Thromb Haemost, 1996,76(3):322-327.

[13] Whelihan MF, Zachary V, Orfeo T, et al. Prothrombin activation in blood coagulation: the erythrocyte contribution to thrombin generation[J]. Blood, 2012,120(18):3837-3845.

[14] Mann KG. Thrombin generation in hemorrhage control and vascular occlusion[J]. Circulation, 2011,124(2):225-235.

[15] Peyrou V, Lormeau JC, Herault JP, et al. Contribution of erythrocytes to thrombin generation in whole blood[J]. Thromb Haemost, 1999,81(3):400-406.

[16] Ernst JD. Epitope mapping of annexin I: antibodies that compete with phospholipids and calcium recognize amino acids 42-99[J]. Biochem J, 1993,289(Pt2):539-542.

[17] Ibrahim HA, Fouda MI, Yahya RS, et al. Erythrocyte phosphatidylserine exposure in beta-thalassemia[J]. Lab Hematol, 2014,20(2):9-14.

[18] Iwata H, Kaibara M. Activation of factor IX by erythrocyte membranes causes intrinsic coagulation[J]. Blood Coagul Fibrinolysis, 2002,13(6):489-496.

[19] Fogelson AL, Neeves KB. Fluid mechanics of blood clot formation[J]. Annu Rev Fluid Mech, 2015,47:377-403.

[20] Valles J, Santos MT, Aznar J, et al. Platelet-erythrocyte interactions enhance alpha(Ⅱb)beta(3) integrin receptor activation and P-selectin expression during platelet recruitment: down-regulation by aspirin ex vivo[J]. Blood, 2002,99(11):3978-3984.

[21] Goldschmidt N, Spectre G, Brill A, et al. Increased platelet adhesion under flow conditions is induced by both thalassemic platelets and red blood cells[[J]. Thromb Haemost, 2008,100(5):864-870.

[22] Manodori AB, Barabino GA, Lubin BH, et al. Adherence of phosphatidylserine-exposing erythrocytes to endothelial matrix thrombospondin[J]. Blood, 2000,95(4):1293-1300.

[23] Wautier JL, Wautier MP. Molecular basis of erythrocyte adhesion to endothelial cells in diseases[J]. Clin Hemorheol Microcirc, 2013,53(1-2):11-21.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.035

R446.1

A

1002-266X(2017)45-0104-03

国家自然科学基金项目(81660025)。

程鹏(E-mail:gxchengpeng@163.com)

2017-09-16)