CALM-AF10与急性白血病关系的研究进展

曹文斋，易海，余茜

(1成都中医药大学临床医学院，成都610075；2自贡市第一人民医院；3中国人民解放军成都军区总医院；4四川省人民医院)

CALM-AF10与急性白血病关系的研究进展

曹文斋1，2，易海3，余茜4

(1成都中医药大学临床医学院，成都610075；2自贡市第一人民医院；3中国人民解放军成都军区总医院；4四川省人民医院)

CALM-AF10所致的急性白血病罕见，且预后极差。CALM编码蛋白是介导细胞内吞作用的接合蛋白，参与细胞内吞和核内蛋白作用。AF10编码蛋白的功能可能是转录因子，可与MLL、CALM等多种基因融合。CALM-AF10导致的白血病临床表现为肝脾大、纵隔肿瘤、中枢神经系统白血病等，对常规化疗药物不敏感或早期复发，预后不良。本文就CALM、AF10的结构和功能，CALM-AF10导致白血病发生的特点及可能的机制进行综述。

白血病；CALM-AF10融合基因；发病机制

难治性白血病是临床治疗中亟待解决的难题，通常需异基因造血干细胞移植才可治愈。但异基因造血干细胞移植供者来源有限、并发症高，限制了其临床应用。随着对难治性白血病发病机制的深入研究，靶向治疗为其指明新的方向。CALM-AF10融合基因是由人第10、11号染色体易位所致，CALM-AF10融合蛋白在难治性白血病患者骨髓中偶有发现。但CALM-AF10融合蛋白在人造血细胞中致白血病发生的确切机制仍不清楚，CALM-AF10未列入常规融合基因检测项目，国内外研究对其认识不足。本文对CALM-AF10导致急性白血病发生的特点及其机制作一综述，为急性白血病的个体化治疗提供依据。

1 CALM的结构与功能

CALM也称为PICALM基因，位于染色体11q23，其编码蛋白是介导细胞内吞作用的接合蛋白，定位于胞质，通过出核基序能与胞膜上的网格蛋白结合。CALM和神经元特异性单体网格蛋白组合蛋白AP180同源，且其同源序列已经在猫、鼠、牛等生物中鉴定出来[1]。

1.1 CALM编码蛋白与细胞的内吞作用 细胞的内吞作用主要由网格蛋白介导。网格蛋白在囊泡中正常运输，通常需要接合蛋白的配合。接合蛋白的作用非常复杂。首先，接头蛋白3(AP3)可能作为一种网格蛋白接合蛋白介导艾滋病病毒相关信号事件的发生。其次，AP1和AP2稳定网格蛋白的浆膜功能并帮助其在高尔基体外侧形成络合物。AP180同源物可参与网格蛋白结合和内吞作用。同样，AP180/CALM同源物可能调节细胞内小囊泡的大小。最后，CALM在铁的运输中发挥重要作用。研究证实CALM促进细胞对铁的吸收，加速人红细胞增多症疾病进展[2]。CALM基因点突变导致造血功能无效和功能性缺铁症。

1.2 CALM编码蛋白与核内蛋白的作用 最新研究发现，CALM编码蛋白还可能与核内蛋白相互作用。新的蛋白质CATS(在胸腺和脾脏表达)显示其与CALM相互作用，稳定CALM-AF10融合蛋白并且增加CALM和CALM-AF10融合蛋白核定位。CATS可能是介导了CALM-AF10的恶性转化，或者通过CALM-AF10蛋白质调节CATS蛋白质的性能[3]。

2 AF10的结构与功能

AF10也称MLLT10基因，位于染色体10p12，编码蛋白质，并且在复发的t易位中作为克隆基因MLL配合体[4]。人类AF10序列在外显子22和23之间遗失124核苷酸，但这些核苷酸存在于大多数已表达序列标志的人群和小鼠的同源染色体标准序列中。以上核苷酸序列插入导致部分AF10编码蛋白羧基末端移码。

2.1 AF10的生理功能 AF10编码蛋白在人体很多组织表达[5]，是高度保守的蛋白家族成员，包括AF17、BR140和CEZF蛋白。数据分析显示，AF10编码蛋白的职能可能是转录因子[6]。AF10编码蛋白包括植物同源域(PHD)手指的结构保守区域，参与大部分转录因子介导染色质的基因调节。AF10编码蛋白还包含扩展的PHD域，作为非白血病相关的蛋白质域，参与其他蛋白质相关的同型低聚反应。AF10还包含AT-hook基序，最初发现于非组蛋白染色体蛋白质，富含于高迁移率组蛋白，能与DNA结合。此外，AF10在部分亚型中，包含双向核定位信号区和富含谷氨酰胺的C末端[7]。

2.2 AF10的病理功能 Chaplin等[5]认为，AF10是克隆MLL染色体易位的配偶体。染色体10p12在11q区域发生臂内倒位，导致AF10和MLL发生融合[8]。MLL-AF10融合蛋白剔除分析表明存在于AF10羧基端的亮氨酸拉链基序对白血病的发生至关重要。H3K79甲基转移酶端粒沉默干扰物1(hDOT1L)被认为是H3K79甲基转移酶通过hDOT1L和AF10相互作用，参与MLL-AF10介导白血病的发生。

3 CALM-AF10导致急性白血病的特点

CALM-AF10最初发现于弥漫性组织细胞性淋巴瘤患者淋巴肿瘤组织内，并由此克隆建立U937细胞系[9]。此后，CALM-AF10更常发现于急性T淋巴细胞性白血病，特别是γ/δ TCR型及未成熟表型T淋巴细胞白血病[10]。美国国立卫生研究院对200例急性髓系白血病(AML)患者进行全基因组和转录组测序的结果表明，2%患者呈CALM-AF10融合基因阳性[11]。Asnafi等[12]从144位T淋巴细胞白血病中鉴定出20例CALM-AF10融合基因阳性，约占14%。CALM-AF10见于M1、M2、M4、M5、M7型以及嗜酸性粒细胞白血病、粒细胞肉瘤等[13]，提示恶性转化的靶点可能是多能造血前体细胞。CALM-AF10患者临床表现包括肝脾大、纵隔肿瘤、中枢神经系统白血病等，对常规化疗药物不敏感或早期复发，预后不良[14]。

4 CALM-AF10导致急性白血病发生的机制

4.1 CALM-AF10融合基因导致急性白血病发生的机制 CALM-AF10作为白血病驱动突变基因已在小鼠模型中得到证实。通过逆转录病毒导入CALM-AF10并进行同种小鼠骨髓移植，受体小鼠在3～6个月发生急性白血病，其表型特征显示其共表达髓系标志Mac1、Gr-1及淋巴系标志B220，并检出免疫球蛋白重排[1]。而通过构建Vav造血系统特异性CALM-AF10转基因小鼠模型，小鼠在1年左右发生急性白血病，表型与前述模型类似，证明CALM-AF10融合基因能导致急性白血病的发生[15]。通过测序发现产生的白血病大多伴发二次突变形成，如FLT3-ITD等，这也是该模型潜伏期长的原因所在，而前述模型通过病毒介导，从而使CALM-AF10融合基因在更多的基因位点得到充分渗入，缩短了致病潜伏期。

4.2 CALM-AF10融合蛋白导致急性白血病发生的机制 CALM-AF10融合蛋白致人白血病机制仍不清楚，该类型白血病表现为HOXA基因簇高度活化，这与MLL类型白血病相似[16]。AF10能与MLL、CALM等多种基因融合，AF10能通过OM-LZ基序结合组蛋白H3第79位赖氨酸(H3K79)甲基转移酶DOT1L，而DOT1L能使H3K79甲基化，从而上调HOXA等基因的表达[17]。Armstrong等[18]用组蛋白甲基转移酶DOT样蛋白(DOT1L)抑制剂对MLL-AF10及CALM-AF10等小鼠白血病模型有很好的作用，能抑制白血病细胞增殖，促进细胞分化。证明DOT1L在白血病发病中发挥了重要作用；但DOT1L抑制剂却不能抑制CALM-AF10阳性U937细胞增殖，而DOT1L抑制剂EPZ-5676的Ⅰ期临床试验中，28例儿童及成人MLL白血病只有2例获得完全缓解，提示其他因素参与了AF10阳性白血病的发生[19]。

定位实验表明，CALM-AF10融合蛋白定位于胞质，但也零星分布于胞核，考虑到CALM含有出核基序，可能通过干扰AF10正常的核定位从而导致H3K79甲基化异常[20]。CALM-AF10白血病融合蛋白导致全基因组H3K79低甲基化状态，诱发染色体不稳定[3]。有研究表明，CALM的出核基序是导致白血病的必要条件，而将CALM的出核基序和AF10的OM-LZ基序形成融合，便足以导致白血病发生[21]。其他含出核基序的胞吞AP(如EPS15)等能与AF10融合，可能是导致白血病的共同特征。出核基序能识别并通过核孔上的出核因子(CRM1)介导出核，抑制CRM1，并在一定程度上抑制CALM-AF10的增殖，提示出核信号在白血病发生中确实扮演了重要角色。最新研究表明，CRM1也定位于HOXA基因，通过募集CALM-AF10融合蛋白，增强HOXA基因转录[22]。然而，通过酵母双杂交方法检测发现，蛋白CATS可与CALM相互作用，并能增加CALM-AF10融合蛋白核定位，提示CATS可能介导白血病恶性转化，但CATS和CALM相互作用位点并不在CALM出核基序上，这使得CALM-AF10致病机制变得更加复杂与模糊。

急性白血病的发病机制至今尚未完全明了，但大量研究已经证实急性白血病的发生与多种HOX基因及转录因子的表达、某些基因突变密切相关。目前白血病虽有一些新的治疗手段及异基因造血干细胞移植已应用于临床，但总体治愈率仍低于60%。且仍有许多新的基因突变及潜在致癌基因仍未完全明了。在成人和儿童AML或急性淋巴细胞白血病患者中，CALM-AF10融合基因导致复发的染色体易位，经常伴随预后不良。因此，研究CALM-AF10在造血细胞中产生的致白血病效应的确切机制，探讨CALM-AF10蛋白复合物的构成及与核酸的相互作用，探明CALM-AF10驱动的白血病细胞内的最真实情况，可能为治疗急性白血病提供更加合理有效的靶点，从而提高疾病预后。

[1] Scotland PB, Heath JL, Conway AE, et al. The PICALM protein plays a key role in iron homeostasis and cell proliferation[J]. PLoS One, 2012,7(8):e44252.

[2] Ishikawa Y, Maeda M, Pasham M, et al. Role of the clathrin adaptor PICALM in normal hematopoiesis and polycythemia vera pathophysiology[J]. Haematologica, 2015,100(4):439-451.

[3] Conway AE, Scotland PB, Lavau CP, et al. A CALM-derived nuclear export signal is essential for CALM-AF10-mediated leukemogenesis[J]. Blood, 2013,121(23):4758-4768.

[4] Chaplin T, Bernard O, Beverloo HB, et al. The t(10;11) translocation in acute myeloid leukemia (M5) consistently fuses the leucine zipper motif of AF10 onto the HRX gene[J]. Blood, 1995,86(6):2073-2076.

[5] Chaplin T, Ayton P, Bernard OA, et al. A novel class of zinc finger/leucine zipper genes identified from the molecular cloning of the t(10;11) translocation in acute leukemia[J]. Blood, 1995,85(6):1435-1441.

[6] Linder B, Jones LK, Chaplin T, et al. Expression pattern and cellular distribution of the murine homologue of AF10[J]. Biochim Biophys Acta, 1998,1443(3):285-296.

[7] Debernardi S, Bassini A, Jones LK, et al. The MLL fusion partner AF10 binds GAS41, a protein that interacts with the human SWI/SNF complex[J]. Blood, 2002,99(1):275-281.

[8] Morerio C, Rapella A, Tassano E, et al. MLL-MLLT10 fusion gene in pediatric acute megakaryoblastic leukemia[J]. Leuk Res, 2005,29(10):1223-1226.

[9] Sundstrom C, Nilsson K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937)[J]. Int J Cancer, 1976,17(5):565-577.

[10] Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia[J]. N Engl J Med, 2013,368(22):2059-2074.

[11] Chen L, Deshpande AJ, Banka D, et al. Abrogation of MLL-AF10 and CALM-AF10-mediated transformation through genetic inactivation or pharmacological inhibition of the H3K79 methyltransferase Dot1l[J]. Leukemia, 2013,27(4):813-822.

[12] Asnafi V, Radford-Weiss I, Dastugue N, et al. CALM-AF10 is a common fusion transcript in T-ALL and is specific to the TCRgammadelta lineage[J]. Blood, 2003,102(3):1000-1006.

[13] Caudell D, Aplan PD. The role of CALM-AF10 gene fusion in acute leukemia[J]. Leukemia, 2008,22(4):678-685.

[14] Caudell D, Zhang Z, Chung YJ, et al. Expression of a CALM-AF10 fusion gene leads to Hoxa cluster overexpression and acute leukemia in transgenic mice[J]. Cancer Res, 2007,67(17):8022-8031.

[15] Deshpande AJ, Cusan M, Rawat VP, et al. Acute myeloid leukemia is propagated by a leukemic stem cell with lymphoid characteristics in a mouse model of CALM/AF10-positive leukemia[J]. Cancer Cell, 2006,10(5):363-374.

[16] Ishikawa Y, Maeda M, Pasham M, et al. Role of the clathrin adaptor PICALM in normal hematopoiesis and polycythemia vera pathophysiology[J]. Haematologica, 2015,100(4):439-451.

[17] Okada Y, Jiang Q, Lemieux M, et al. Leukaemic transformation by CALM-AF10 involves upregulation of Hoxa5 by hDOT1L[J]. Nat Cell Biol, 2006,8(9):1017-1024.

[18] Armstrong SA, Golub TR, Korsmeyer SJ. MLL-rearranged leukemias: insights from gene expression profiling[J]. Semin Hematol, 2003,40(4):268-273.

[19] Daigle SR, Olhava EJ, Therkelsen CA, et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor[J]. Cancer Cell, 2011,20(1):5-65.

[20] Daigle SR, Olhava EJ, Therkelsen CA, et al. Potent inhibition of DOT1L as treatment of MLL-fusion leukemia[J]. Blood, 2013,122(6):1017-1025.

[21] Lin YH, Kakadia PM, Chen Y, et al. Global reduction of the epigenetic H3K79 methylation mark and increased chromosomal instability in CALM-AF10-positive leukemias[J]. Blood, 2009,114(3):651-658.

[22] Conway AE, Haldeman JM, Wechsler DS, et al. A critical role for CRM1 in regulating HOXA gene transcription in CALM-AF10 leukemias[J]. Leukemia, 2014,29(2):423-432.

国家自然科学基金资助项目(81500132)。

余茜(E-mail：365610647@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.035

R733.71

A

1002-266X(2017)05-0104-03

2016-09-27)