上转换纳米粒子在细胞检测及肿瘤靶向治疗中的应用进展

杨光，陈梦茜，金在顺

(牡丹江医学院基础医学院，黑龙江牡丹江157000)

上转换纳米粒子在细胞检测及肿瘤靶向治疗中的应用进展

杨光，陈梦茜，金在顺

(牡丹江医学院基础医学院，黑龙江牡丹江157000)

上转换纳米粒子(UCNPs)具有发光谱窄、发光强度高、不产生自体荧光与光漂白、粒子本身无毒等优点。将UCNPs与特定抗体相结合形成的抗体-UCNPs轭合物具有靶向性，作为新一代荧光探针用于细胞的靶向检测。改变UCNPs的成分，可使UCNPs作为一种纳米载体，搭载特定化疗药物对肿瘤病灶进行靶向治疗；同时UCNPs还具有光热治疗和光动力治疗的性能，对肿瘤组织具有良好的协同治疗效果。

上转换纳米粒子；靶向探针；靶向治疗；分子成像

近年来，上转换纳米粒子(UCNPs)作为一种新兴的发光材料，在生物医学、化学、光学、环境监测等领域引起了人们极大关注[1, 2]。由于其独特的发光性能，已经成功地应用于细胞靶向检测及肿瘤精准治疗。近年来其性能不断被改进，UCNPs可作为载体，装载特定化疗药物，靶向杀死肿瘤细胞；同时对肿瘤还具有光热治疗(PTT)和光动力治疗(PDT)的作用。UCNPs可作为一种性能优越的靶向探针应用于医学成像，其已与常规影像检查相结合，提高影像检查的准确度。现对UCNPs在细胞检测、肿瘤靶向治疗方面的应用进展予以综述。

1 UCNPs在细胞检测中的应用

1.1 肿瘤细胞 UCNPs靶向检测肿瘤的功能已经在细胞实验中被证实。UCNPs合成后，表面分布有大量的带有长烷基链的油酸，其在水中不能均匀分布而成一种疏水状态。Cao等[3]使粒子表面连接6-氨基己酸，6-氨基己酸功能化的UCNPs既表现出良好的水溶性，又可以借助6-氨基己酸上的氨基基团与叶酸(FA)结合。结果显示，FA/6-氨基己酸功能化的UCNPs具有靶向性，成功地作为一种探针应用于人口腔表皮样癌细胞(KB)靶向成像。UCNPs也可应用于其他种类细胞的靶向成像，Wang等[4]将其与人宫颈癌细胞(HeLa)共同培养后上转换荧光成像，结果显示 NaYF4: Yb3+, Er3+UCNPs与HeLa细胞结合是基于兔抗癌胚抗原(CEA)8抗体与CEA之间特异性反应而发生的靶向结合，CEA抗体修饰后的UCNPs适用于HeLa细胞的靶向成像。为使UCNPs既表现出亲水性同时也要具有靶向性，Bogdan等[5]使UCNPs表面功能化连接肝素和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)。由于HeLa细胞表面存在有大量的bFGF受体[6]，功能化后的UCNPs不仅可以在水中均匀分部，而且理论上功能化后该粒子(肝素-bFGF-UCNPs)也具备了与HeLa细胞特异性结合的能力。未功能化的UCNPs与细胞培养后，细胞上几乎未见荧光，而功能化的UCNPs与细胞培养后则可见明显荧光。但之前文献[7]已经得出结论，肝素-UCNPs与HeLa细胞的结合并非是特异性结合，而是由于肝素作为阴离子多糖与细胞表面的蛋白质和其他带电分子发生反应导致的结合。因此得出结论，由于bFGF与bFGFR之间的特异性反应，肝素-bFGF-UCNPs得以与HeLa细胞靶向结合，进而可用于对HeLa细胞的靶向成像[5]。以上研究均证实功能化后的UCNPs可用于HeLa细胞的靶向成像。因此可以推测，将两个实验融合，制备出一种靶向性更强的UCNPs，使之既偶联有CEA抗体同时又带有bFGF。与HeLa细胞共同孵育后，理论上该UNCPs对于HeLa细胞检测的敏感性和靶向性将大大增强，将来有希望应用于女性宫颈癌的早期筛查。

1.2 心肌细胞 缝隙连接是相邻心肌细胞间电、化学偶联的通道,亦是心室肌成为功能性合胞体的重要结构。心肌有缝隙连接蛋白(CX)40、43与45的表达,心室肌主要表达CX43。心肌在缺血再灌注、肥厚、衰竭、高胆固醇与糖尿病条件下,心肌细胞缝隙连接均发生重塑。由以上疾病引起的重塑特征相似，均为CX43表达降低合并非均匀化、侧面化与去磷酸化[8]。因此，可以通过检测CX43的表达量来评估心肌细胞的生长状况。Nagarajan等[9]将二氧化硅包覆的NaYF4: Yb3+, Er3+UCNPs氨基功能化，与抗CX43抗体共价结合，形成CX43抗体-UCNPs轭合物。CX43抗体-UCNPs轭合物与心肌细胞(H9c2)共培养，随着培养时间的延长，细胞不断增殖。对该细胞进行激光共聚焦成像发现，释放明亮上转换荧光的位点明显增多。这主要是由于起初细胞数目较少，心肌细胞间的缝隙连接通道还未构建完成，进而导致CX表达量很少。待细胞增殖到一定密度后，心肌细胞彼此相邻更为紧密，细胞间的缝隙连接通道形成，从而导致CX表达量也明显升高，上转换荧光位点也较之前增多。由于鼠成肌细胞CX43表达量非常低[10]，将鼠成肌细胞与CX43抗体-UCNPs轭合物在同样的条件下培养，随着培养时间延长，细胞表面的上转换荧光的位点数依然很少。这证实了CX43抗体-UCNPs与H9c2细胞CX的结合是基于CX43抗体与CX43之间的特异性结合。因此认为UCNPs还可用于检测心肌细胞生长状态。通过此方法对CX43的表达量进行准确检测，将其作为一个重要指标用于评估高血压、糖尿病、心肌梗死等疾病的预后情况，同时对于早期筛查心脏疾病也具有广阔的应用前景。

1.3 骨髓间充质干细胞(BMSCs) BMSCs在临床应用方面已经引起了广泛关注，尤其是应用于骨损伤修复和骨再生。研究表明，移植的BMSCs通过分化成为成骨细胞促进骨的再生[11]，但其作用机制目前仍不明确。Ma等[12]制备了一种UCNPs用其标记和监测正处于分化过程中的兔BMSCs。他们首先将NaYF4: Yb3+, Er3+UCNPs用带负电荷的聚丙烯酸(PAA)和带正电荷的聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)去修饰形成PAH-PAA-UCNPs，以提高UCNPs被细胞摄取的能力[13]。将兔BMSCs(rBMSCs)和PAH-PAA-UCNPs在成骨细胞培养基中一起诱导培养。发现rBMSCs内可见大片绿色荧光，且随着PAH-PAA-UCNPs浓度增加荧光强度也变得更为强烈。因此认为rBMSCs可以被PAH-PAA-UCNPs高效标记，但并不能证明在rBMSCs分化过程中PAH-PAA-UCNPs对细胞起到了追踪标记的作用。骨钙素(OC)是由成骨细胞产生的一种典型蛋白，通过免疫荧光实验对骨钙素进行检测可确定是否发生了成骨细胞分化[14]。为了进一步验证，将rBMSCs与PAH-PAA-UCNPs在生骨分化培养基中诱导培养，发现在诱导培养14 d后，细胞内可见OC表达阳性并且随着诱导时间的延长OC表达量明显增加，说明rBMSCs分化良好。同时，在分化的全过程中被标记的rBMSCs内可见强烈的上转换荧光。因此认为在rBMSCs成骨分化过程中，PAH-PAA-UCNPs可用于标记、长期追踪检测rBMSCs。这为以后对干细胞治疗疾病、损伤修复机制的研究奠定了基础。

2 UCNPs在肿瘤靶向治疗中的应用

Chen等[15]利用UCNPs的光学特点将其成功的应用于DNA传感器的发明。DNA传感器主要是由UCNPs和两个寡核苷酸(DNA1-生物素和DNA2-罗丹明)构成。实验发现，当制备好的DNA传感器未与靶DNA结合时，在980 nm 近红外光(NIR)激发下，仅见UCNPs所释放的上转换荧光，DNA2-罗丹明所释放的荧光微乎其微。随着靶DNA长度的增加，在580 nm处检测到的荧光强度也随之增加，这与罗丹明释放光波长相一致，而UCNPs所释放的绿色上转换荧光强度则明显下降。由于DNA传感器与靶DNA之间遵循着碱基互补配对原则，因此，通过检测罗丹明所释放的荧光强度，可以对感兴趣的DNA进行靶向检测，有助于在基因水平对疾病进行早期诊断，尤其对于恶性肿瘤的早期预测意义重大。

2.1 作为化疗药物的载体 UCNPs可作为载体，搭载化疗药物靶向杀死肿瘤细胞，避免化疗药物对正常细胞的损伤。Wang等[16]将阿霉素(DOX)与叶酸功能化的UCNPs(FA-UCNPs)相连接。FA受体阳性的人口腔表皮样癌细胞(KB)分别与UCNPs-FA-DOX、UCNPs-DOX进行培养。结果显示UCNPs-FA-DOX培养的KB细胞活性降低。将FA受体阴性的人宫颈癌细胞分别与UCNPs-FA-DOX、UCNPs-DOX进行培养，显示两组HeLa细胞活性无明显变化。证明在FA的靶向作用下，KB细胞对UCNPs-FA-DOX的内吞作用增加。与外界环境相比，细胞内pH值下降，DOX在细胞内大量释放，进而导致KB细胞活性降低。因此认为UCNPs不仅应用于细胞的靶向检测，其在载有化疗药物的条件下，还具备靶向杀肿瘤细胞的潜能。Yang等[17]以Y(OH)CO3: Yb3+, Er3+纳米球为原料，与叶酸相结合，成功合成了NaYF4-PEI-FA轭合物。且通过实验证实该空心/介孔结构的粒子具有无毒性以及对于HeLa细胞的检测具有靶向性。将NaYF4-PEI-FA轭合物与DOX结合，发现与NaYF4-PEI-FA-DOX轭合物共同培养的HeLa细胞内红色信号明显多于与NaYF4-PEI-DOX轭合物共同培养的细胞，证明前者细胞对DOX的摄取量更多。因此，空心/介孔结构的NaYF4: Yb3+, Er3+纳米粒子有潜力应用于细胞的靶向成像以及抗肿瘤药物的搭载。与Wang等研究相比，Yang等改进了纳米材料的性能，DOX的运载效率得到了较大提高，进而可以高效杀伤、杀死肿瘤细胞。

2.2 PTT与PDT 将UCNPs的载体性能与其产生的光热性能相结合，成功制备了新型纳米探针，可对肿瘤进行药物和光热协同治疗。PTT作为一种微创治疗方法，已经引起了研究者的广泛关注。在近红外光的激发下，新型粒子可将近红外光能转变为热能作用于肿瘤细胞进行抗癌治疗[18]。Liu等[19]成功制备了具有上述功能的UCNPs，该粒子中心部分含有硫化铜(CuS)，最外围被聚丙烯酸(PAA)包覆，形成UCNPs-CuS-PAA耦合物(UCP)，证实UCP具有良好的光热性能。他们还发现由于粒子表面的PAA带有负电荷而DOX带有正电荷，UCP对于DOX的搭载能力也提升至18%。将其经尾静脉注射于背部长有肝癌(H22肿瘤细胞)的小鼠体内，发现肿瘤大小及重量均减小。因此认为在808 nm NIR的激发下，UCP可作为一种良好的探针应用于肿瘤的药物、光热协同治疗，大大提高了肿瘤的治疗效率。

PDT是利用光敏药物和激光活化治疗肿瘤的一种新方法。在一定波长光的刺激下，光敏剂会将能量传递给细胞周围的氧，形成活性氧簇(ROS)。ROS可引起一系列的肿瘤血管反应，如血管痉挛、血流淤滞、血栓形成、血管永久闭塞等，进而诱导细胞凋亡甚至死亡[20]。

Liang等[21]制备了一种集细胞靶向成像与光动力疗法于一体的上转换纳米探针。将玫瑰红(RB)光敏剂封装于粒子内，表面连接蛋白G(LPG)修饰，粒子与抗上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗体相结合，成功制备具有靶向成像功能和光动力疗法的UCNPs(UCNPs-RB-LPG-Ab)。将UCNPs-RB-LPG-Ab分别与人结肠癌细胞(HT29)和EpCAM阴性表达的小胶质细胞(BV2)培养1 h，发现HT29细胞表面可见大量的上转换荧光而BV2细胞表面的荧光强度则微乎其微。此外他们还做了两组对照试验，将未连接有抗体的UCNPs-RB-LPG和连接有CRY104抗体的UCNPs-RB-LPG-CRY104分别与HT29细胞培养，上转换成像后细胞表面均未见绿色荧光，他们认为UCNPs-RB-LPG-Ab可用于HT29细胞的靶向成像。将HT29细胞分别与UCNPs-RB-LPG-Ab和UCNPs-LPG-Ab孵育，并且给予相同的980 nm NIR激发时间，发现前一组细胞活性明显低于后一组。因此，他们得出结论UCNPs-RB-LPG-Ab不仅可以用于肿瘤细胞的靶向成像，正是由于粒子内RB的存在，其拥有了对肿瘤细胞靶向PDT作用。UCNPs的PDT可使肿瘤组织内呈现缺氧状态，生物还原药物替拉扎明(TPZ)作为一种化疗药物在缺氧状态下可被活化，对肿瘤细胞具有杀伤作用。Liu等[22]运用以上原理将UCNPs、光敏剂(PS)和TPZ相结合，成功制备UCNPs-PS-TPZ。将其与HeLa细胞混合培养并被暴露在NIR下一定时间，发现与UCNPs-PS-TPZ共同培养的HeLa细胞凋亡数明显增多。另外还发现，UCNPs-PS-TPZ明显抑制了小鼠体内肿瘤的生长。因此他们认为UCNPs-PS-TPZ在对肿瘤有化疗与PDT双重作用。

PTT与PDT是无创光治疗的主要方法[23]。二者结合明显促进光治疗效率，达到协同治疗效果。由于适当水平的热效应增加了肿瘤内血液流动，肿瘤内氧含量增加，改善了光动态治疗功效[24]。Chen等[25]制备具有PDT和PTT双功能的UCNPs，在相同808、980 nm NIR激发时间下分别与小鼠乳腺癌细胞(4T1)培养，发现与具有PDT和PTT双重功能UCNPs一起培养的4T1细胞的活性比与具有单一治疗功能的UCNPs一起培养的细胞要低。进一步研究发现，尾静脉注射具有PDT和PTT双功能UCNPs的裸鼠体内肿瘤明显缩小。因此认为，PDT和PTT对于肿瘤的协同治疗效果要明显好于其中单一方法的疗效。

UCNPs作为一种全新的对比剂已广泛用于基础医学研究，并且已经取得了巨大突破。UCNPs从最初仅应用于细胞的靶向成像发展至搭载有特定的化疗药物对肿瘤细胞精准杀死，并与其独特的PDT、PTT性能相结合对肿瘤组织进行协同治疗，提高了肿瘤治疗效率。为以后对疾病的早期诊断、靶向定位、精准治疗奠定了基础。这将有可能提高肿瘤的治愈率，减少病死率。同时也极大地推动了分子成像技术的发展，为以后医学事业的发展指明了方向。

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国家自然科学基金资助项目(81172204)；牡丹江医学院研究生创新科研项目(2016YJSCX-03MY)。

金在顺(E-mail：zaishun5@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.034

R443

A

1002-266X(2017)05-0100-04

2016-10-07)