熊果酸对荷骨肉瘤大鼠免疫功能的影响

陈伟 刘海生 魏萌 王丽红 师艳艳

熊果酸对荷骨肉瘤大鼠免疫功能的影响

陈伟 刘海生 魏萌 王丽红 师艳艳

目的 研究熊果酸对荷骨肉瘤大鼠免疫功能的影响及其机制。方法 通过于Wistar大鼠股骨远端骨髓腔中注射接种骨肉瘤UMR106细胞的方法建立荷骨肉瘤大鼠模型并腹腔注射给予不同剂量的熊果酸100、50、25 mg/(kg·d)和顺铂2.5 mg/(kg·d)进行干预治疗，疗程5天。观察大鼠生存状态和肿瘤生长状况；称量瘤体质量并计算抑瘤率，HE染色法观察肿瘤组织形态结构改变，MTT法测定脾淋巴细胞转化率；ELISA法测定血清中白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)含量；流式细胞术检测血液中T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分率并计算CD4+/CD8+比值。结果 经熊果酸干预治疗5天荷骨肉瘤大鼠饮食状况好转，瘤体缩小、瘤体质量减轻且硬度较差，呈现肿瘤细胞皱缩、组织片状坏死等变化；抑瘤率显著升高，脾淋巴细胞转化率显著升高，血清中IL-2、TNF-α含量显著降低，血液中CD4+显著升高、CD8+百分率显著降低，CD4+/CD8+比值显著升高，且均具有一定的剂量依赖性。结论 熊果酸具有提高荷骨肉瘤大鼠免疫功能的作用，其机制可能与熊果酸能够有效提高脾淋巴细胞转化率，降低IL-2、TNF-α含量以及提高CD4+百分率、降低CD8+百分率而提高CD4+/CD8+比值有关。

熊果酸； 骨肉瘤； 免疫功能； 机制

骨肉瘤发病率居原发恶性骨肿瘤之首[1-2]，每年新发患者约5/100万[3]，多发于青少年且死亡率高，是临床上亟待解决的一个难题。近年来，病理生理学研究发现肿瘤疾病患者多处于免疫系统抑制、免疫活性细胞功能低下状态，从而使肿瘤细胞易于生长和转移[4-5]，因此以改善患者免疫功能为切入点或许是研发高效、低毒新型抗肿瘤药物的新思路。熊果酸(ursolic Acid，UA)是一种具有抗氧化、抗炎、抗纤维化等多种生物学活性的五环三萜类化合物[6-10]，现代药理学研究发现熊果酸对肺癌、肝癌、舌癌等生长均具有一定的抑制作用[11-13]。本实验通过股骨远端骨髓腔注射接种骨肉瘤UMR106细胞的方法建立荷骨肉瘤大鼠模型，研究熊果酸对荷骨肉瘤大鼠免疫功能的影响并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

清洁级Wistar大鼠(雄性，7周龄，体质量220～240 g)购自河北省实验动物中心，许可证号：SCXK(冀)2013-1-003；大鼠骨肉瘤UMR106细胞株购自中科院上海生化与细胞生物学研究。

1.2 药物与试剂

熊果酸(陕西慧科植物开发有限公司，纯度≥98%)；顺铂(江苏豪森药业股份有限公司，规格：30 mg，6 mL)；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国HyClone公司)；MTT、DMSO(美国Sigma公司)；白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；HE试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型的制备与分组 取实验用骨肉瘤UMR106细胞，经解冻复苏后，植入DMEM高糖培养基进行培养并取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×106/mL，无菌条件下注射接种(0.2 mL)于实验用Wistar大鼠股骨远端骨髓腔中以制备荷骨肉瘤大鼠模型，2周后接种部位出现包块、直径≥5 mm即可认定造模成功[14-15]。取100只模型大鼠按随机数字表法随机分为模型组、熊果酸高、中、低[100、50、25 mg/(kg·d)]和顺铂2.5 mg/(kg·d)组，各20只；并另取20只同龄清洁级雄性Wistar大鼠设为正常对照组。药物的配制：准确称量熊果酸并用含5 mg/mL羧甲基纤维素钠的PBS溶液(pH 7.4)溶解并依此稀释分别配制成含熊果酸50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL的混悬液[16]；并用含5 mg/mL羧甲基纤维素钠的PBS溶液(pH 7.4)溶解配制成含顺铂1.25 mg/mL的混悬液。熊果酸各治疗组和顺铂组均腹腔注射给药(2 mL/kg)进行治疗，模型组和正常对照组同步给予等体积(2 mL/kg)含5 mg/mL羧甲基纤维素钠的PBS溶液，1次/天，疗程5天。

1.3.2 测定瘤体质量、计算抑瘤率、观察肿瘤组织形态结构改变 麻醉后取肿瘤组织并称量，抑瘤率计算公式：抑瘤率(%)=(模型组瘤体质量-治疗组瘤体质量)/模型组瘤体质量×100%；取称量后肿瘤组织，经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片后，行常规脱蜡水化处理，参照HE试剂盒方法步骤行常规HE染色和复染，然后通过显微镜观察肿瘤组织形态结构改变。

1.3.3 测定脾淋巴细胞转化率 参照李晓冰等[17]报道的实验方法测定脾淋巴细胞转化率：取脾脏组织行研磨匀浆后制备单细胞悬液，加入10 mL NH4Cl(10%)经37℃水浴10分钟，转移至96孔培养板后每孔滴加100 μL PHA液(植物血球凝集素，实验孔)，设对照孔并滴加100 μL培养液，于37℃、5%CO2培养箱内培养48小时后滴加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培养4小时后去上清，加入DMSO 200 μL，反应10分钟后通过酶标仪测定波长490 nm处吸光度(OD)值，以刺激指数(SI)反映脾淋巴细胞转化率(SI)：SI=PHA刺激孔OD/对照孔OD。

1.3.4 测定血清中IL-2、TNF-α水平 经腹主动脉取血并离心(1500 rpm，10分钟)取血清，参照试剂盒说明通过酶标仪采用比色法测定血清中IL-2、TNF-α水平。

1.3.5 测定血液中CD4+、CD8+百分率并计算CD4+/CD8+比值 经腹主动脉取血并离心(10000 rpm，5分钟)后弃上清，参照关硕等[18]报道的方法，通过流式细胞仪分析检测CD4+、CD8+百分率并计算CD4+/CD8+比值。

1.4 统计学处理

运用软件SPSS 17.0进行统计分析，计量资料组间均数比较采用one-way ANOVA分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠肿瘤组织病变的影响

肿瘤组织切片经HE染色后通过显微镜观察，结果如图1所示：模型组荷骨肉瘤大鼠肿瘤组织细胞胞质饱满、胞核呈两个或多个、核仁深染，未见异常；熊果酸各剂量组和顺铂组肿瘤组织细胞呈现皱缩、数量减少、核染色质边集以及片状坏死区等病理性改变，熊果酸诱导肿瘤组织病变的作用呈一定剂量依赖性。

2.3 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠瘤体重量及抑瘤率的影响

熊果酸能够有效减轻荷骨肉瘤大鼠瘤重并提高抑瘤率，并呈一定剂量依赖性；熊果酸高剂量组瘤体质量和抑瘤率与顺铂组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结果如表1所示。

2.4 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠脾淋巴细胞转化率的影响

结果如表2所示：与正常对照组比较发现，模型组荷骨肉瘤大鼠脾淋巴细胞转化率显著升高；熊果酸治疗5天能够有效降低荷骨肉瘤大鼠脾淋巴细胞转化率，并呈一定剂量依赖性；熊果酸高剂量组脾淋巴细胞转化率显著低于顺铂组。

表1 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠瘤体质量及抑瘤率的影响±s)

注： 与模型组比较,aP<0.05，bP<0.01。

表2 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠脾淋巴细胞转化率的影响±s)

注： 与正常对照组比较,aP<0.05,与模型组比较,bP<0.05，与顺铂组比较,cP<0.05。

注：A模型组；B顺铂组；C熊果酸高剂量组；D熊果酸中剂量组；E熊果酸低剂量组

图1 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠肿瘤组织病变的影响(HE×400)

2.5 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠血清中IL-2、TNF-α含量的影响

结果如表3所示：与正常对照组比较发现，模型组荷骨肉瘤大鼠血清中IL-2、TNF-α含量均显著升高；经熊果酸或顺铂治疗5天能够有效降低荷骨肉瘤大鼠血清中IL-2、TNF-α含量，且呈一定剂量依赖性；熊果酸高剂量组IL-2含量较顺铂组显著降低，而TNF-α含量两组间无显著性差异(P>0.05)。

表3 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠血清中炎症因子水平的影响±s)

注： 与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05,与顺铂组比较，cP<0.05。

2.6 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+、CD8+百分率及CD4+/CD8+比值的影响

结果如图2和表4所示：与正常对照组比较发现，模型组荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+百分率显著降低、CD8+百分率显著升高，而CD4+/CD8+比值显著降低；经熊果酸或顺铂治疗5天能够有效提高荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+百分率，降低血液中CD8+百分率，提高血液中CD4+/CD8+比值；熊果酸高剂量组CD4+、CD8+百分率、CD4+/CD8+比值与顺铂组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

目前临床上对于骨肉瘤的治疗主要采取手术辅以放化疗的方案，但80%的患者因确诊时体内已经出现转移病灶而致使手术治疗效果不佳[19]，5年生存率仅30%左右。因此，以提高荷骨肉瘤患者免疫功能、抑制肿瘤生长和转移为切入点研究高效、低毒的新型抗肿瘤药物是临床上亟待解决的问题。

注：A正常对照组；B模型组；C顺铂组；D熊果酸高剂量组； E熊果酸中剂量组；F熊果酸低剂量组

图2 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+、CD8+百分率

脾淋巴细胞转化百分率是反映机体细胞免疫的基本指标[20]，也是研究药物对T淋巴细胞影响的常用方法。IL-2是体内非常重要的免疫调节因子，其在恶性肿瘤的免疫应答中起着非常关键的调节作用[21]，Wang Z等[22]研究发现IL-2具有促肿瘤免疫耐受的生物学作用，该作用与IL-2的浓度及作用时间等因素密切相关。Anquetil F等[23]研究发现当机体荷肿瘤时体内TNF-α合成及分泌增加，过量的TNF-α不但能够抑制IgG和lgM产生，也能导致T淋巴细胞不能对肿瘤细胞产生正常的免疫反应。T淋巴细胞CD4+分子和CD8+分子共同介导细胞免疫应答反应[24-25]，CD4+/CD8+比值在机体免疫调节中具有重要作用，其比值变化能够准确反映出机体免疫状态。

表4 熊果酸对荷骨肉瘤大鼠血液中CD4+、CD8+百分率及CD4+/CD8+比值的影响

注： 与正常对照组比较,aP<0.05,与模型组比较,bP<0.05。

熊果酸是一种具有多种生物学活性的五环三萜类化合物[1-5]，近年来熊果酸抗肿瘤活性逐渐得到医药研究工作者的关注。本实验通过建立荷骨肉瘤大鼠模型并给予熊果酸进行干预治疗，研究发现经熊果酸治疗能够改善荷骨肉瘤大鼠一般生存状态，呈剂量依赖性地诱导细胞坏死、降低瘤体质量、提高抑瘤率；与模型组比较，发现经熊果酸治疗能够有效提高荷骨肉瘤大鼠脾淋巴细胞转化率，降低血清中炎症细胞因子IL-2和TNF-α水平，提高血液中CD4+百分率、降低CD8+百分率，提高CD4+/CD8+比值，其中熊果酸100 mg/(kg·d)组脾淋巴细胞转化率显著高于顺铂组(P<0.05)、IL-2含量水平显著低于顺铂组(P<0.05)，提示熊果酸能够改善荷骨肉瘤大鼠免疫功能，而表现出对移植瘤组织生长的抑制作用。

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(本文编辑： 董历华)

Effects of ursolic acid on immune function of osteosarcoma rats

CHENWei，LIUHaisheng，WEIMeng，etal.

HandanCentralHospital，Handan056001，China

Correspondingauthor：CHENWei，E-mail：hdsyyzhrf@163.com

Objective To investigate the effects and mechanism of ursolic acid(UA) on immune function of osteosarcoma cancer rats. Methods The osteosarcoma cancer rat models were conducted by injecting osteosarcoma cancer cell line UMR106 and were treated with UA 100，50，25 mg/(kg·d) and Cisplatin 2.5 mg/(kg·d) by intraperitoneal injection for 5 d. The rats’ general states and tumor growth conditions were observed，the histopathological changes of tumor tissue were observed by HE staining; he tumor weight was detected and inhibition rate was calculated, the spleen lymphocyte transformation rate was detected by MTT, the content of IL-2 and TNF-α in serum were detected, the percentage of CD4+, CD8+in blood were detected and the ratio of CD4+/CD8+was calculated. Results The diet situation of the rats in UA treated groups were improved, tumor were reduced and hardness were less，tumor cell showed shrinkage, tissue necrosis, etc; the tumor inhibition rate were increased; the spleen lymphocyte transformation rate were significantly increased; the content of IL-2 and TNF-α in serum were significantly decreased; the CD4+percentage in blood were significantly increased, the CD8+percentage was significantly decreased, the ratio of CD4+/CD8+in UA treated groups were significantly increased. The effect of the above mentioned effects of UA has a certain dose dependence. Conclusion UA can effectively improve the immune function of osteosarcoma cancer rat; which perhaps related to its effects of increasing the spleen lymphocyte transformation rate, reducing the content of IL-2 and TNF-α, increasing CD4+percentages，decreasing CD8+percentages and raising the ratio of CD4+/CD8+.

Ursolic Acid； Osteosarcoma cancer； Immune function； Mechanism

056001 邯郸市中心医院骨三科(陈伟、魏萌、王丽红、师艳艳)；邯郸市人民医院外一科(刘海生)

陈伟(1976- )，硕士，主治医师。研究方向：骨科疾病。E-mail：hdsyyzhrf@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.006

2016-10-22)