不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量比较

张洪梅 史晓飒 刘腾飞 马维维 张艳聪 史新元

·论著·

不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量比较

张洪梅 史晓飒 刘腾飞 马维维 张艳聪 史新元

目的 分析比较10批不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量，为蝉花的质量评价及生产用药的筛选提供方法和基础数据。方法 采用高效液相色谱法分别测定不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量。结果 腺苷以江苏茅山的蝉花含量最高，为44.957 μg/g，广西玉林的最低，为11.331 μg/g；虫草素以四川宜宾的含量最高，为191.725 μg/g，江西九江的蝉花含量最低，为25.437 μg/g；各产地麦角甾醇含量差异相对较小，范围为120.024～301.652 μg/g。结论 不同产地蝉花中的腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量差异较大；该方法适用于蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量测定，为其质量评价提供参考。

蝉花； 腺苷； 虫草素； 麦角甾醇； 高效液相色谱法

蝉花又名蝉蛹草、蝉茸等，是蝉拟青霉等真菌寄生于一些蝉若虫后形成的菌虫复合体，隶属真菌门、子囊菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，是传统中药材之一[1-3]。现代研究表明，蝉花具有调节人体免疫[4-6]、改善肾功能[7-9]、抗菌[10-11]、抗肿瘤[12-14]、抗氧化等多种药理活性。

作为一种传统的药用真菌，蝉花富含多种必需氨基酸、多糖、腺苷、麦角甾醇、虫草素等活性物质[15-16]。其中，腺苷是一种嘌呤核苷，其含量已被用作多种虫草的质控指标。有报道表明，蝉花中的腺苷含量约为冬虫夏草中的4倍[17]。腺苷涉及中枢神经系统中多种生理过程的调节，具有防止心律失常、降低血压、抑制血小板凝集等作用[18]。虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、提高人体免疫力等生理活性[19]，在医药方面具有广泛的应用前景。麦角甾醇是真菌类细胞膜上的特征甾醇，在虫草类真菌中含量相对稳定，专一性强，通常作为质量控制指标之一，它是维生素D2的前体物质，其次生代谢产物可产生麦角甾醇氧化物，对真菌具有重要的生理功能，且具有抗癌、减毒等广泛的生物学活性[20]。

目前，利用HPLC法对蝉花中核苷类成分进行测定已有较多文献报道[17,21-23]，但对其麦角甾醇含量测定的研究较少，蝉花的质量评价指标较为单一；且现有研究多集中于对蝉花和其他虫草类活性成分的比较，缺少对不同产地蝉花中有效成分的差异性研究。中国蝉花资源分布广泛，由于各产地的环境差异较大，蝉花中的活性成分也存有一定差异，导致蝉花品质参差不齐。因此，分析比较各产地蝉花中的有效成分，科学评价各产地蝉花的质量十分有意义。本文收集了安徽、浙江、福建等十个产地的蝉花药材，采用HPLC法对腺苷、虫草素、麦角甾醇的含量进行了测定，以了解不同产地蝉花中活性成分的含量是否存在差异、综合评价不同产地蝉花的质量，以期为蝉花的质量评价提供方法和依据，并为临床与生产用药的筛选提供参考。

1 仪器与材料

1.1 供试样品

安徽、福建、广东、广西玉林、江苏、九江、四川北川、四川绵阳、四川宜宾、浙江十个产地的蝉花，均为干品。将其粉碎为粉末，装入密封袋，置于干燥器中保存。

1.2 试剂

标准品：腺苷(批号：110879-200202，中国食品药品检定研究院)；虫草素(批号：58-200202，中国药品生物制品检定所)；麦角甾醇(批号：20150905，成都普菲德生物技术有限公司)；甲醇为色谱醇(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.3 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪(PDA检测器，美国沃特世公司)；超声波清洗器(昆山市一波超声仪器有限公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；电热恒温水浴锅HW SY21-KP4型(北京市长风仪器仪表公司)。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备

2.1.1 腺苷标准液的制备 精密称取腺苷标准品2.32 g，置于20 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，溶解摇匀，作为储备液。精密吸取腺苷储备液，用甲醇依次稀释成浓度为5.8、11.6、23.2、58.0、116.0 μg/mL的系列溶液，作为腺苷标准品溶液。

2.1.2 虫草素标准液的制备 精密称取虫草素标准品10.00 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，溶解摇匀，即为1 mg/mL虫草素储备液。精密吸取虫草素储备液，用甲醇依次稀释浓度为25.0、50.0、75.0、100.0、125.0 μg/mL的系列溶液，作为虫草素标准品溶液。

2.1.3 麦角甾醇标准液的制备 精密称取麦角甾醇标准品3.80 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，溶解摇匀，作为麦角甾醇储备液。精密吸取麦角甾醇储备液，用甲醇依次稀释成浓度为9.28、18.56、37.13、74.25、148.50 μg/mL的系列溶液，作为麦角甾醇标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 腺苷供试品溶液的制备 称取各产地蝉花粉末(过50目筛)约0.20 g置于具塞锥形瓶中，精密加入20%乙醇溶液25 mL，超声提取30分钟，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，按色谱条件进行含量测定。

2.2.2 虫草素供试品溶液的制备 称取各产地蝉花粉末(过50目筛)约0.25 g置于锥形瓶中，精密加入蒸馏水20 mL，在70℃水浴锅中浸提5小时，冷却，过滤，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，按色谱条件进行含量测定。

2.2.3 麦角甾醇供试品溶液的制备 称取各产地蝉花粉末(过50目筛)约0.25 g置于锥形瓶中，精密加入88%乙醇溶液50 mL，在80℃水浴锅中提取45分钟，冷却，过滤，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，按色谱条件进行含量测定。

2.3 色谱条件

2.3.1 腺苷含量测定 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱：0～10分钟，1%A～5%A；10～15分钟，5%A～15%A；15～20分钟，15%A～20%A；20～30分钟，20%A；30～35分钟，20%A～35%A；35～40分钟，35%A～1%A，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为260 nm，进样量为20 μL。腺苷对照品及样品HPLC测定结果见图1。

图1 腺苷标准品(A)和江苏茅山产地蝉花样品(B)色谱图

2.3.2 虫草素含量测定 色谱柱同2.3.1。流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱：0～5分钟，15%A～20%A；5～10分钟，20% A；10～15分钟，20% A～15% A，流速为0.8 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为260 nm，进样量为20 μL。虫草素对照品及样品HPLC测定结果见图2。

图2 虫草素标准品(A)和四川宜宾产地蝉花样品(B)色谱图

2.3.3 麦角甾醇含量测定 色谱柱同2.3.1。流动相为甲醇-水(98∶2)，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为283 nm，进样量为20 μL。麦角甾醇对照品及样品HPLC测定结果见图3。

2.4 线性关系考察

依次吸取腺苷系列标准品溶液各20 μL，根据2.3.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以标准品进样量(μg)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，计算回归方程。同法，按2.3.2、2.3.3项下色谱条件分别得虫草素标准品和麦角甾醇标准品的标准曲线及回归方程，见表1。

结果表明，腺苷在线性范围5.8～116.0 μg/mL、虫草素在线性范围25.0～125.0 μg/mL、麦角甾醇在线性范围9.28～148.5 μg/mL内呈现良好的线性关系，符合试验要求。

图3 麦角甾醇标准品(A)和安徽产地蝉花样品(B)色谱图

成分回归方程相关系数(R2)线性范围(μg/mL)腺苷Y=44.9407X-0.01090.9995.8～116.0虫草素Y=25.1982X+0.80050.99925.0～125.0麦角甾醇Y=87.0091X-0.09740.9999.28～148.5

2.5 精密度考察

取标准品溶液腺苷23.2 μg/mL、虫草素25.0 μg/mL、麦角甾醇37.13 μg/mL，分别按2.3项下相应色谱条件进行进样分析，进样6次，每次20 μL，测定峰面积，并计算RSD分别为腺苷0.98%、虫草素1.32%、麦角甾醇1.55%，表明仪器精密度符合试验要求。

2.6 加样回收试验

取已知含量蝉花粉末(过50目筛)0.2 g，共6份，分别加入浓度为腺苷5.8 μg/mL、虫草素25.0 μg/mL、麦角甾醇37.13 μg/mL的标准品溶液1 mL，按照上述制备方法及色谱条件制样、测定，并计算回收率、RSD值分别为腺苷95.7%、2.04%，虫草素98.4%、1.72%，麦角甾醇100.2%、1.79%，结果表明，准确度符合试验要求。

2.7 重复性考察

取安徽产地蝉花粉末(过50目筛)按上述供试品溶液制备方式制备6份供试品溶液，精密吸取20 μL，注入色谱仪，测定并计算。结果样品中腺苷、虫草素、麦角甾醇平均含量分别为39.04 μg/g、140.52 μg/g、301.65 μg/g，RSD分别为2.32%、1.27%、1.73%，重复性符合试验要求。

2.8 稳定性考察

取安徽产地蝉花供试品溶液20 μL，分别测定0、5、10、15、20、25小时腺苷、虫草素、麦角甾醇的峰面积值，计算RSD值分别为1.78%、1.46%、1.53%，表明供试品溶液中腺苷、虫草素、麦角甾醇成分在25小时内稳定。

2.9 样品测定

精密吸取供试品溶液20 μL，分别进样，记录峰面积，外标定量测得各产地蝉花中腺苷、虫草素、麦角甾醇的含量。见表2。

从表中可以看出，各产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇含量均存在一定差异，其中，腺苷和虫草素含量差异较大。腺苷以江苏茅山的蝉花含量最高，为44.957 μg/g，广西玉林的最低，为11.331 μg/g，相差近4倍；虫草素以四川宜宾的含量最高，为191.725 μg/g，江西九江的含量最低，仅为25.437 μg/g，相差8倍左右。相较而言，各产地麦角甾醇含量差异较小，范围为120.024～301.652 μg/g。

表2 不同产地蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量

整体而言，四川绵阳、四川宜宾和安徽大别山的蝉花中三种成分含量较高，一定程度上反映了这三个产地的蝉花质量较好。

3 讨论

近年来，蝉花由于其丰富的营养价值和广泛的药理活性备受关注，有研究表明，蝉花是一种不亚于冬虫夏草和蛹虫草的优质虫草[17]，显示了蝉花广阔的药用前景。其中，有效成分的研究是开发并评价蝉花药用价值的基础，本文采用HPLC法分别对安徽、浙江、江西等十个产地的蝉花中腺苷、虫草素和麦角甾醇的含量进行了测定。通过对标准品和供试品的线性范围、精密度、准确度、稳定性和重复性的考察，证明了该方法的适用性。

不同产地蝉花供试品中腺苷、虫草素和麦角甾醇成分含量存在明显差异，这可能与各地的环境不同、菌种差异及产品保存时间和方式等有关。本实验检测对比了蝉花中三种成分的含量差异，为综合评价各地蝉花质量提供了实验依据，并可为将来蝉花的临床应用与生产用药提供一定参考。

但由于条件所限，本研究仅对十个产地蝉花中核苷类成分的腺苷、虫草素进行了定量分析，不能反映蝉花中整体核苷成分信息；对于蝉花甾醇类成分检测，也仅对麦角甾醇进行了简单定量研究，没有考虑其他甾醇类物质。此外，目前对于各产地蝉花的药理药效的差异尚不了解，可于进一步的实验中将其与活性成分差异相结合，为蝉花资源的进一步开发利用甚至不同用途的蝉花的选择提供理论上的依据及可行性分析。

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(本文编辑： 董历华)

Comparing research on contents of adenosine, cordycepin and ergosterol in cordyceps cicadae

ZHANGHongmei，SHIXiaosa，LIUTengfei，etal.

SchoolofChineseMaterialMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China

Correspondingauthor：SHIXinyuan，E-mail：xyshi@126.com

Objective The contents of adenosine、cordycepin and ergosterol in cordyceps cicadae from 10 different areas were compared to provide basis for the quality evaluation and utilization of cordyceps cicadae. Methods The high performance liquid chromatography(HPLC) was used to measure the contents of adenosine、cordycepin and ergosterol in cordyceps cicadae from different areas. Results The highest content of adenosine in cordyceps cicadae was 44.957 μg/g from Jiangsu，and the lowest was 11.331 μg/g from Guangxi. The highest content of cordycepin was from Sichuan and the content was 191.725 μg/g，and that from Jiangsu was 25.437 μg/g，which was the lowest. The content of ergosterol in cordyceps cicadae from different areas varied from 120.024 μg/g to 301.652 μg/g. Conclusion There is difference among the contents of adenosine、cordycepin and ergosterol in Cordyceps cicadae from different areas；the method can be used to determine them in cordyceps cicadae，and to provide the reference for the quality evaluation of cordyceps cicadae.

Cordyceps cicadae； Adenosine； Cordycepin； Ergosterol； HPLC

100102 北京中医药大学中药学院[张洪梅(硕士研究生)、史晓飒(硕士研究生)、刘腾飞(博士研究生)、马维维(硕士研究生)、张艳聪(硕士研究生)、史新元]

张洪梅(1993- )，女，2016级在读硕士研究生。研究方向：中药生物技术研究。E-mail：lovvendy@126.com

史新元(1974- )，女，博士，教授。研究方向：中药生物技术研究。E-mail：xyshi@126.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.010

2016-08-22)